Testing short LNA-modified oligonucleotides for Duchenne Muscular Dystrophy gene therapy

Tese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015A base hereditária de cada organismo vivo é o genoma, uma longa sequência de ácido desoxirribonucleico (DNA), que contém a informação genética organizada em genes. Em eucariotas, os genes são compostos por exões, interrompidos por intrões. Os exões contêm a informação genética que é traduzida em proteína. Uma vez que a informação genética se encontra no núcleo da célula, e a maquinaria de tradução está localizada no citoplasma, é necessária a formação de um ácido ribonucleico (RNA) mensageiro temporário (pré-mRNA). Este pré-mRNA é processado no núcleo, por uma série de passos que incluem o capping da extremidade 5’, a remoção de intrões e junção de exões, o splicing e a clivagem e poliadenilação da extremidade 3’. O RNA mensageiro resultante (mRNA) é exportado para o citoplasma, tornando-se disponível para os ribossomas, onde a tradução em proteína decorre. O splicing é um processo altamente complexo e regulado no qual estão envolvidas centenas de proteínas. O splicing alternativo, que ocorre quando um único gene origina mais do que uma sequência de mRNA, é um mecanismo importante para a regulação da expressão génica. Uma vez que o splicing e o splicing alternativo são mecanismos extremamente importantes e conservados na Natureza, a sua disrupção pode levar a doenças. Apesar de a disrupção destes mecanismos estar subjacente a muitas doenças hereditárias e adquiridas, a modulação do splicing através da utilização de oligonucleotídeos antisense pode ter aplicações terapêuticas. A modulação de splicing pode ser conseguida in vitro com o uso de compostos químicos ou oligonucleotídeos antisense (AONs) que se podem ligar a uma determinada sequência do pré-mRNA e regular o splicing do gene, quer para restaurar a função do gene ou para inibir a expressão génica. A modulação do splicing oferece esperança para o combate de muitas doenças genéticas, que são atualmente incuráveis. O exemplo mais notável desta aplicação terapêutica é na Distrofia Muscular de Duchenne (DMD), causada principalmente por mutações nonsense e de frame-shift no gene DMD, localizado no cromossoma X, que codifica para a proteína distrofina. As distrofias musculares constituem um grupo heterogéneo de doenças genéticas musculares caracterizadas por um progressivo enfraquecimento, atrofia e degeneração muscular. As distrofias musculares associadas a deficiências no gene da proteína distrofina, podem apresentar vários fenótipos, desde o mais grave e mais comum – a Distrofia Muscular de Duchenne (DMD), até ao mais ligeiro – a Distrofia Muscular de Becker (BMD). A DMD mais severa, apresenta uma incidência de 1 em cada 3500 recém-nascidos do sexo masculino, apresentando a BMD, a mais ligeira, uma incidência de 1 em cada 18 500. A distrofina é a proteína responsável pela manutenção da estabilidade da membrana das fibras musculares. Mutações neste gene levam à perda de função da proteína, sendo esta patologia caracterizada pela ausência de distrofina funcional no músculo cardíaco, esquelético e liso. Apesar dos esforços, nenhuma terapia eficaz e clinicamente aplicável foi ainda desenvolvida, sendo no entanto possível atrasar o onset da doença recorrendo a terapias com glucocorticoides. Têm sido investigadas terapias genéticas de correção da reading frame, sendo as abordagens mais promissoras as que visam o skipping de exões com mutações framedisrupting do pré-mRNA, que apesar de introduzirem deleções, conseguem gerar transcritos in-frame permitindo a síntese de uma proteína, que mesmo sendo mais pequena, consegue ser funcional. Na terapia desta patologia, o skipping de um exão mediado por oligonucleotídeos antisense (AONs) pode restaurar a open reading frame (ORF) e permitir a síntese de uma proteína parcialmente funcional. O skipping de um exão pode ser induzido pela ligação de oligonucleotídeos antisense, direcionados para um ou ambos os locais de splice ou sequências internas do exão. Teoricamente, a correção da reading frame pode ser conseguida com o skipping de um ou mais exões que flanqueiem a deleção, ou com o skipping de exões in-frame que contenham mutações nonsense, ou com o skipping de exões duplicados. Os oligonucleotídeos antisense Drisapersen (com a estrutura química 2’-O-metil) e Eteplirsen (com a estrutura química morfolino) estão atualmente a ser testados em ensaios clínicos de Fase III como terapia para a Distrofia Muscular de Duchenne, e a aguardar aprovação da Agência Europeia de Medicamentos (EMA) e da Federal Drug Administration (FDA). Estes oligonucleotídeos antisense conseguem restaurar a reading frame da distrofina promovendo o skipping do exão 51 do gene da distrofina, sendo esta abordagem aplicável a aproximadamente 13% dos pacientes que sofrem desta patologia. Uma vez que os oligonucleotídeos antisense, que têm sido estudados e que avançaram para ensaios clínicos, têm mostrado um sucesso limitado no que diz respeito a eficácia clínica, neste trabalho procuramos testar a utilização de um diferente tipo de oligonucleotídeos: oligonucleotídeos modificados com Locked Nucleic Acid (LNA) – LNA-AONs, como nova estratégia para alcançar a correção do gene mutado, resgatando a expressão da proteína distrofina, induzindo o skipping direcionado do exão 51. Procurámos descobrir se estes LNA-AONs podem ser utilizados para terapias de modulação de splicing com aumento da eficiência. Os nucleótidos LNA possuem uma unidade de açúcar alterada que forma uma ponte metileno. Esta modificação permite propriedades melhoradas em termos de aumento de estabilidade de hibridação com a sequência alvo, de alta sensibilidade, boa descriminação de incompatibilidades (mismatches), baixa toxicidade e estabilidade metabólica aumentada, ajustando às propriedades necessárias para terapia humana. Neste trabalho, linhas celulares derivadas de mioblastos de pacientes com DMD e indivíduos normais (Mamchaoui, K. et al, 2011) foram utilizados para indução in vitro de skipping do exão 51 do pré-mRNA da distrofina e o modelo animal mdx52 (Aoki, Y. et al, 2012), ratinhos que apresentam uma deleção do exão 52 no gene DMD, foi utilizado para indução in vivo de skipping do exão 51 do pre-mRNA da distrofina nos tecidos musculares. Pesquisámos skipping do exão 51 ao nível dos transcritos, através da utilização de técnicas de RT-PCR e pesquisámos a restauração da produção da proteína, através da utilização de técnicas de Western Blot e Imunofluorescência. Os nossos resultados mostraram skipping eficaz do exão 51 e restauração da produção da proteína distrofina em mioblastos distróficos de pacientes, transfectados com oligonucleotídeos modificados com LNA utilizando concentrações tão baixas como 5nM. No modelo animal, o ratinho mdx52, após cinco injeções intravenosas na cauda, a cada duas semanas, com 1mg/kg de LNA-AON, duas semanas após a última injeção, não foi detetado skipping do exão 51 por RT-PCR, nem proteína via Western Blot. No entanto, aglomerados de fibras positivas para a distrofina foram detetadas por imunohistoquímica em ratinhos mdx52 tratados,e não em ratinhos injectados como controlo, levando a crer que são fibras em que a produção de distrofina foi induzida terapeuticamente devido ao LNA-AON usado. Ocasionalmente, observamos a presença de fibras positivas isoladas para a distrofina em ratinhos não tratados, no entanto nestes casos estamos perante fibras revertentes, ou seja, fibras isoladas ocasionais que ocorrem naturalmente e parecem expressar distrofina corretamente localizada. Estas fibras revertentes poderão ser exemplos onde, por acaso, mutações secundárias adicionais ou eventos intrínsecos aberrantes de splicing proporcionam o skipping de um ou mais exões adicionais de forma a restaurar a reading frame correta original, permitindo a produção de uma proteína funcional. Para que ocorra uma reversão do fenótipo da DMD para um fenótipo menos severo, como o da BMD, ou para evitar distrofias musculares em humano e ratinho, é necessária a expressão de níveis de 20 a 30% da distrofina normal no tecido muscular. O objetivo deste projeto foi testar se LNA-AONs poderiam ser utilizados para terapias de modulação splicing com maior eficiência, em relação aos AONs já estudados. Nós demonstramos que o resgate de expressão de distrofina realizando o skipping do exão 51 é viável em linhas celulares derivadas de mioblastos in vitro, e em ratinhos mdx52 distróficos in vivo. Os resultados apresentados, obtidos com o modelo celular, parecem muito promissores, a fim de alcançar uma boa recuperação da proteína distrofina em mioblastos de doentes DMD bem como os alcançados em em ratinhos mdx52. Seguidamente será necessária otimização do sistema de entrega dos oligonucleotídeos para o tecido muscular de forma generalizada, uma vez que o tratamento de todo o organismo é um desafio e que os tecidos envolvidos são pósmitóticos, sendo aproximadamente 30 a 40% do corpo humano constituído por músculo. A melhoria da eficiência de modulação de splicing e da biodistribuição de oligonucleotídeos antisense (AONs) pode reduzir a dose terapêutica e intervalo das administrações, minimizando a potencial toxicidade, efeitos off-target, e custos. Com este trabalho mostrámos a aplicabilidade de pequenos oligonuleótidos LNA modificados para terapia genética da Distrofia Muscular de Duchenne, abrindo caminho para uma pesquisa de métodos mais eficientes para terapia genética por modulação de splicing em tratamento sistémico de uma doença genética hereditária.Genetic disorders are caused by abnormalities in an individual’s DNA. Novel therapeutic strategies for this types of diseases have been emerging, especially on therapies that involve the modulation of disease-related gene expression. Modulation of splicing using antisense oligonucleotides (AONs) is feasible in vitro and can have possible therapeutic applications. The most notable example is in Duchenne Muscular Dystrophy (DMD), a genetic hereditary disease caused mainly by frame-shifting or nonsense mutations in the DMD gene in chromosome X, which encodes for the dystrophin protein, essential for membrane stability of muscle fibers. In DMD cells, antisense-mediated exon skipping can restore the open reading frame and allow synthesis of partly functional dystrophin proteins instead of non-functional proteins, transforming DMD in the milder Becker Muscular Dystrophy (BMD). The antisense oligonucleotides Drisapersen (2’-O-methyl chemistry) and Eteplirsen (morpholino chemistry) are currently being tested in clinical trials as a therapy for DMD. These aim to restore the dystrophin reading frame by promoting skipping of exon 51, an approach that is applicable to approximately 13% of DMD patients. Locked Nucleic Acid (LNA) modified oligonucleotides carry an altered sugar moiety that forms a methylene bridge allowing improved properties in terms of increased duplex stability, high sensitivity, good mismatch discrimination, low toxicity and increased metabolic stability, fitting the properties needed for human therapy. An oligonucleotide wuth this chemistry is currently awaiting for clinical application as HCV infection therapy after good results in clinical trials. We aim to test if LNA oligonucleotides (LNA-AON) can be used for splicing modulation therapies, with increased efficiency. In this work, myoblast derived cell lines from patients and mdx52 mice were used for in vitro and in vivo induction of skipping of DMD-exon 51, respectively. We looked for skipping of exon 51 at the transcript level (RT-PCR) and for restoration of protein production (Western Blot and Immunofluorescence). Our results show effective skipping of exon 51 and restoration of dystrophin protein production in dystrophic myoblasts transfected with the LNA-AON at concentrations as low as 5nM. In the animal model, the mdx52 mouse, after five biweekly tail intravenous injections of 1mg/kg with the LNA-AON, we were able to visualize clusters of dystrophin positive fibers therapeutically induced by the LNA-AON on cryosections of selected muscles. With this work we showed the applicability of short LNA-modified oligonucleotides for Duchenne Muscular Dystrophy gene therapy, paving the way for a search of more efficient methods for gene therapy splicing modulation in systemic treatment of an inherited genetic disease

Adversity, depressive symptoms and suicide attempts: study of women in community and comparison between women in prison and women in the community

Dissertação de mestrado integrado em Psicologia (área de especialização em Psicologia da Justiça)A relação entre adversidade na infância, depressão e tentativas de suicídio tem sido estudada, mas nunca o foi em amostras exclusivamente femininas da comunidade. Por outro lado a literatura sugere que existe uma elevada prevalência de adversidade, depressão e tentativas de suicídio em reclusas. Este estudo teve como objetivos analisar estas variáveis em mulheres da comunidade e compará-las com um grupo de reclusas, analisando o contributo da adversidade para a depressão e tentativas de suicídio. Um total de 394 mulheres (211 reclusas e 183 da comunidade) completou o Adverse Childhood Experiences Study Questionnaire e a sub-escala da depressão do Psychopathological Symptom Inventory. As mulheres na comunidade relatam muitas experiências adversas e estas são preditoras da sintomatologia depressiva e das tentativas de suicídio. As reclusas relataram mais abuso sexual, abuso de substâncias na família, familiares em reclusão e divórcio dos pais, enquanto as da comunidade relataram mais violência doméstica. Não há diferenças entre os dois grupos quanto ao total de experiências adversas. A depressão e as tentativas de suicídio são superiores nas reclusas. Nos dois grupos a adversidade é preditora tentativas de suicídio. Programas de prevenção comunitários e projetos prisionais que considerem a história de vida e problemas específicos são necessários em contexto prisional.The relationship between childhood adversity, depression and suicide attempts has been studied, but never in exclusively female community samples. On the other hand the literature suggests that there is a high prevalence of adversity, depression and suicide attempts in female inmates. This study aimed to analyze these variables in women from the community and compare them with a group of inmates, analyzing the contribution of adversity to depression and suicide attempts. A total of 394 women (211 inmates and 183 from community) completed the Adverse Childhood Experiences Study Questionnaire and the depression subscale of the Psychopathological Symptom Inventory. Women in the community reported many adverse experiences and these are predictors of depressive symptoms and suicide attempts. Female inmates reported more sexual abuse, substance abuse in the family, family members in prison and divorced parents, while the community reported more domestic violence. There are no differences between the two groups in the total number of adverse experiences. Depression and suicide attempts are higher among inmates. In both groups the adversity predicts suicide attempts. Prevention community programs and projects that consider life history and specific problems are needed in the prison context

Impact of global warming on the spawning success, metabolism and embryogenesis of a specialized soft coral-feeding nudibranch, Armina maculata

Tese de mestrado. Biologia (Ecologia Marinha). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012Temperature is considered as one of the most important physical variables controlling the life of marine organisms. Thus, understanding how they will respond to future thermal scenarios is of great relevance. The present study aimed to investigate, for the first time, the spawning success, embryonic development and metabolic rates of a specialized soft coral-feeding nudibranch, Armina maculata, under different thermal scenarios, which reflect: i) the present-day average spring (18ºC), early-summer (22ºC) and summer (24ºC) temperatures, and ii) the projected near-future warming (27ºC, +3ºC, IPCC 2007), a temperature that the species already experiences during heat wave events in Sado’s estuary. At 22ºC, A.maculata’s adults spawned more frequently and the embryos showed higher survival rates (~88%), indicating this temperature as the optimal for the reproduction of this species. On the other hand, the project near-future warming (27ºC) promoted metabolic suppression in adults, i.e., it triggered the shut-down of several biochemical functions. Additionally, under such thermal scenario, spawning events were scarce, ceased after three weeks, feeding intake was absent and the individuals perished after seven weeks of incubation. Furthermore, early ontogenetic stages (blastula, gastrula, trocophore, active veliger, newly-hatched, veliger) showed concomitant negative effects with increasing temperature. Embryonic development was dramatically shortened followed by increased energy expenditure rates. Moreover, egg mass analysis showed visible deleterious effects on embryo’s development and survival, with the latter decreasing up to 45%. Hence, the ability of A.maculata to overcome the developmental and physiological challenges faced at the projected near-future warming scenario will dictate its long-term survival success.As alterações climáticas emergiram no último século como uma preocupação global. O aquecimento da superfície dos oceanos é uma realidade incontestável e as consequências desta tendência podem ter efeitos catastróficos nas comunidades marinhas. Estudos preveem que a superfície dos oceanos sofra um aumento de 3ºC até 2100 ditando grandes alterações nas características das grandes massas de água, como o aumento do seu nível médio, que causará um forte impacte nas comunidades costeiras, ou mudanças nas correntes, com consequências graves a nível de dispersão larvar e disponibilidade alimentar, por exemplo. Compreender como irão as comunidades marinhas responder às rápidas mudanças nos ecossistemas constitui uma prioridade na investigação científica. A temperatura é um dos principais fatores físicos que influencia os processos fisiológicos nos organismos marinhos ectotérmicos, tais como taxas de respiração, crescimento, alimentação e reprodução. No entanto, a resposta de cada organismo às variações de temperatura está dependente dos seus limites de tolerância térmica e estágio de desenvolvimento. Além destes limites, a sobrevivência e fitness de um organismo podem estar comprometidos, principalmente numa perspetiva a longo termo. Assim, um organismo exposto prolongadamente a elevadas temperaturas aumenta o seu metabolismo exponencialmente até um nível em que a capacidade respiratória e cardiovascular atingem o seu máximo, seguindo-se um conjunto de reações fisiológicas, tais como, falhas no sistema enzimático, desnaturalização de proteínas e danos membranares que podem resultar na morte do indivíduo. Embora a ordem Nudibranchia seja a maior dentro dos Heterobranchia (Euthyneura, Nudipleura), poucos estudos reportam o efeito da temperatura na ecologia fisiológica dos nudibrânquios e não existem referências quanto à ecologia de Armina maculata. Como seres invertebrados e bênticos, que habitam principalmente as zonas intertidal e subtidal, o efeito do aumento da temperatura pode representar um obstáculo à persistência de muitas espécies. Os nudibrânquios são uma espécie carnívora, alimentando-se de um espectro de seres bênticos e sésseis, que não sejam largamente explorados por outros taxa. Adicionalmente, muitas espécies de nudibrânquios apresentam associações predador-presa, designando-se por espécies estonofágicas, estando intimamente ligados à distribuição e sobrevivência da sua única fonte de recursos alimentares. Assim sendo, a extinção local de determinada presa pode conduzir paralelamente à extinção da espécie de nudibrânquio que dela depende. Esta condição agrava-se perante um cenário de aquecimento global e, consequentemente, a capacidade de resposta e adaptação dos nudibrânquios deve ser avaliada conjuntamente com a capacidade de resposta de adaptação da sua presa. Num cenário futuro de altas temperaturas, onde é esperado um aumento nas taxas metabólicas dos organismos, uma diminuição nas reservas nutricionais pode resultar em falhas no sucesso reprodutor, já que grande parte da energia de um nudibrânquio adulto é direcionada para a reprodução. Atendendo-se ao fato de que a maioria dos nudibrânquios são espécies semélparas com um ciclo de vida anual, entende-se que o estado nutricional do individuo, bem como, as condições ambientais prevalentes durante o período de copulação, desova e eclosão larvar, estejam intimamente ligados ao sucesso reprodutor da espécie. Estudos sobre o sucesso reprodutor do nudibrânquio Adalaria proxima demonstraram que a temperatura afetava significativamente todas as atividades relacionadas com a reprodução, nomeadamente, periodicidade na colocação de posturas, duração do período de desova e viabilidade das massas de ovos. Assim sendo, compreende-se que, embora os nudibrânquios adultos tenham uma maior plasticidade na resposta às variações anuais de temperatura, o seu investimento reprodutor seja direcionado para um curto e único período de tempo, durante o qual as temperaturas são as ideais para assegurar a sobrevivência da descendência. A maioria das espécies de nudibrânquios possuem uma estratégia reprodutora do tipo “r”, isto é, investem em várias em posturas ao longo do período reprodutor, sendo que cada postura é constituída por milhares de ovos, de forma a superar o efeito da seleção natural sobre a grande variabilidade individual da descendência. Esta estratégia revela-se de especial importância para espécies de nudibrânquios que tenham desenvolvimento larvar planctotrófico. A capacidade de adaptação das espécies de nudibrânquios às adversidades do aquecimento global, pode ficar comprometida logo nos primeiros estágios de vida. Na verdade, é esperado que estes sejam os mais vulneráveis às mudanças de temperatura, por possuírem uma janela de tolerância térmica muito menor que a dos adultos. Estudos realizados em vários moluscos heterobrânquios, demonstraram que o aumento da temperatura diminuía o tempo de desenvolvimento embrionário, com efeitos negativos concomitantes na sobrevivência e morfologia dos embriões. Adicionalmente, a diminuição do período de embriogénese pode levar a um desfasamento temporal entre disponibilidade alimentar e eclosão larvar. No futuro, as larvas recém-eclodidas terão uma maior necessidade de alimento, devido às altas taxas metabólicas esperadas, pelo que a falta de recursos poderá comprometer a sua sobrevivência. A atividade metabólica, por sua vez, pode ser considerada como a função fisiológica de um organismo mais dependente das variações de temperatura. Vários estudos foram realizados na perspetiva de identificar os efeitos das variações térmicas no metabolismo de invertebrados marinhos, comprovando-se que o aumento da temperatura é sempre acompanhado de um aumento nas taxas de consumo de oxigénio. Situações de stress ambiental como extremos de temperatura ou privação de alimento, resultam na ativação de uma resposta de supressão metabólica, em que o organismo diminui os seus gastos energéticos ao máximo, procurando sobreviver até surgirem condições ambientais mais favoráveis. Verifica-se também que a taxa de aumento no consumo de oxigénio é mais significativa nos primeiros estágios de vida de um organismo marinho, bem como em nudibrânquios, corroborando a premissa de que estes estágios são os mais vulneráveis e a sua performance e sobrevivência influenciarão diretamente toda a dinâmica populacional da espécie. Neste sentido, o objetivo do presente estudo foi avaliar, pela primeira vez, o impacte de um cenário futuro de aquecimento na ecologia fisiológica do nudibrânquio A.maculata. Indivíduos adultos da espécie A.maculata foram capturados no estuário do Sado (costa oeste de Portugal) e mantidos sob quatro cenários térmicos diferentes, que refletiam: i) a temperatura média atual da primavera (18ºC), início do verão (22ºC) e verão (24ºC) e, ii) a temperatura prevista para o verão sob um cenário futuro de aquecimento (27ºC, +3ºC, IPCC 2007), experienciada já presentemente pela espécie durante ondas de calor no verão, no estuário do Sado. Para se avaliar os efeitos da temperatura na alimentação e reprodução, os indivíduos adultos foram colocados aos pares em aquários individualizados, permitindo a copulação, visto esta espécie ser hermafrodita mas apenas realizar fecundação cruzada, e alimentados ad libitum com a sua presa, o octocoral Veretillum cynomorium. Após iniciado o período reprodutor, as posturas colocadas foram incubadas nas mesmas condições que os adultos e o seu desenvolvimento foi acompanhado diariamente, verificando-se o efeito do aquecimento na morfologia, sobrevivência e tempo de embriogénese. Por fim, foram medidas as taxas de consumo de oxigénio e determinada a sensibilidade térmica (valores de Q10) desta espécie em adultos e embriões. Embora fosse expetado que as altas taxas metabólicas verificadas nos adultos a temperaturas elevadas (24, 27ºC) fossem acompanhadas por um aumento na ingestão de alimento, tal não se verificou. Na verdade, as maiores taxas foram verificadas a 18 e 22ºC, onde se verificou também a preferência pela presa V.cynomorium. Esta diminuição na procura de alimento pode ser explicada pela ativação de uma resposta de supressão metabólica, que resultou numa diminuição da atividade dos indivíduos e no decréscimo da capacidade respiratória, reprodutora e locomotora, levando à morte dos exemplares, após sete semanas de incubação a 27ºC. Concomitantemente, o cenário de aquecimento (27ºC) teve consequências devastadoras para esta espécie em vários aspetos da sua reprodução. Os adultos mantidos a esta temperatura apenas colocaram posturas durante as primeiras três semanas de teste, as quais demonstraram deformações morfológicas (ex. variações na cor, diminuição no tamanho das capsulas, embriões e larvas recém-eclodidas, nos últimos estágios da embriogénese) e cujo tempo de desenvolvimento até à eclosão foi significativamente encurtado (~5 dias) e acompanhado por altas taxas de mortalidade embrionária (~55%). Como esperado, o consumo de oxigénio aumentou linearmente com o aumento da temperatura, verificando-se a premissa de que este aumento seria mais substancial nos embriões do que nos adultos, visto que os estágios iniciais são os mais vulneráveis a variações térmicas. Por outro lado, os resultados apontam o cenário de 22ºC como a temperatura ótima para a reprodução desta espécie. Elevada frequência de desova associada a altas taxas de sobrevivência embrionária (~88%) e sucesso no desenvolvimento ontogenético, sugerem que esta espécie se reproduza preferencialmente no início do verão. Os resultados deste estudo demonstraram que a temperatura desempenha um papel crucial no ciclo de vida do nudibrânquio A.maculata, determinando vários aspetos das suas respostas fisiológicas a nível alimentar, reprodutivo e metabólico. No entanto, a sobrevivência desta espécie, estará dependente da sua capacidade de adaptação às condições de stress extremo no previsto cenário de aquecimento global

Corporate reputation: A discussion on construct definition and measurement and its relation to performance

AbstractPurpose – The purpose of this paper is to discuss the different approaches to the corporate reputationconstruct, in order to identify a comprehensive definition that can be used for measurement purposes, gapsidentified by previous literature identified. Design/methodology/approach – This is a theoretical essay. The authors analyzed studies that involvethe relationship between corporate reputation and organizational performance, and the attributes of nationaland international corporate reputation ratings. Findings – The authors identified a more comprehensive definition for the reputation construct, andindicated courses for the construct’s measurement, by considering: the judgment by the stakeholders(internal, suppliers, clients and the financial market); periodical evaluations under different organizationalperspectives; attention to theoretical assumptions, among other aspects. Research limitations/implications – The study is a theoretical paper that presents that the research fieldhas many definitions that cannot be used interchangeably. It indicated how the reputation construct shouldbe operationalized for measurement purposes. This study presented a reflection on the relationship betweencorporate reputation and performance, showing that it is not a settled topic in the academy. Practical implications – The study advances the understanding of the reputation construct measurement,considering the adopted definition and the discussion of the attributes of the main ratings on corporatereputation. The adoption of a measurement method that takes into account the definition used in this study andthe features of the methodologies discussed will improve the corporate reputation assessment. Social implications – Literature indicates that a good corporate reputation can affect organizationalperformance and the inverse relationship is also true. As a social implication, it is extremely relevant toimprove the understanding the definition and measurement methods of this construct. Originality/value – This study discusses one of the most important intangible resources for organizations,contributing to the understanding of the difference between the market value and the book value of publiccompanies. Besides it should be considered that there is one lack of a definition directly related to themeasurement of the reputation construct in the literature, a gap in which this study contributes. Keywords Performance, Corporate reputation, Intangible resource

Correção endovascular de aneurisma da artéria renal com a técnica de Moret: caso clínico

ResumoO aneurisma da artéria renal é uma patologia rara, presente em 0,01‐1,30% da população e está frequentemente associado a hipertensão arterial. Pela sua elevada taxa de sucesso, o tratamento endovascular é considerado a primeira opção terapêutica. Os autores apresentam um caso de um aneurisma da artéria renal de 36mm de diâmetro, corrigido através da técnica de Moret. Esta consiste na embolização do aneurisma, enquanto o colo é temporariamente ocluído com um balão. Os autores discutem as vantagens das diferentes técnicas endovasculares e relacionam‐nas com as características anatómicas do aneurisma, fundamentando assim a opção terapêutica tomada.AbstractRenal artery aneurysm is a rare pathology, present in 0.01‐1.30% of the population and it is frequently associated with hypertension. Endovascular treatment is the first option due to its low morbidity and mortality. The authors report a clinical case of a renal artery aneurysm with a 36mm of diameter treated with Moret's technique. It consists in aneurysm embolization while neck is temporary occluded with a balloon. The authors discuss the advantages of the endovascular techniques and relate them with the aneurysm anatomy, justifying their therapeutic option

Avaliação do desempenho e mudança em contabilidade de gestão: o caso do Direção Regional de Administração Educativa da Região Autónoma da Madeira

Os objetivos desta investigação foram compreender como e por que foi introduzido o istema Integrado de gestão e Avaliação do Desempenho na Administração Pública (SIADAP) na Região Autónoma da Madeira (RAM), como e por que se implementou o SIADAP-RAM na Direção Regional da Administração Educativa (DRAE), e, por fim, como tem sido utilizada a informação proveniente do SIADAP-RAM na DRAE e porquê. Com enquadramento na teoria institucional, o estudo de caso fez uma análise dos documentos legais e, com base nos resultados das entrevistas realizadas aos avaliadores e avaliados, concluiu-se que os avaliadores da DRAE não executam o processo de avaliação do desempenho, estabelecido por lei, de forma uniforme. O SIADAP surgiu em substituição do Sistema de Classificação de Serviço. A mudança surgiu por imposição legal, conforme com o fenómeno de isomorfismo coercivo a que se refere a literatura.info:eu-repo/semantics/draf

Evaluation of multivariate biomarker indexes application in ecotoxicity tests with marine diatoms exposed to emerging contaminants

Worldwide anthropogenic activities result in the production and release of potentially damaging toxic pollutants into ecosystems, thereby jeopardizing their health and continuity. Research studies and biomonitoring programs attend to this emerging problematic by applying and developing statistically relevant indexes that integrate complex biomarker response data to provide a holistic approach, reflecting toxically induced alterations at the organism or population level. Ultimately, indexes allow simple result communications, enhancing policy makers understanding, and contributing to better resource and environmental managing policies. In this study three indexes, the integrated biomarker response index (IBR), the bioeffects assessment index (BAI) and principal components analysis (PCA), were evaluated for their sensitivity in revealing toxically induced stress patterns in cells of the diatom Phaeodactylum tricornutum under contaminant exposure. The set of biomarkers selected for index construction comprised the anti-oxidant enzymes APX, CAT and SOD, and the lipid peroxidation marker TBARS. Several significant correlations with the applied concentration gradients were noticed for all indexes, although IBR excelled for its reliability in delivering statistically significant dose-response patterns for four out of the five tested compounds.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Opis zatvorene piometre u divljoj svinji (Sus scrofa, Linnaeus 1758.)

Pyometra is a pus accumulation in the uterine lumen. This paper reports an unusual case of pyometra in a female Sus scrofa of Parque Biologico de Gaia (Avintes, Portugal). The animal was of advanced age, and the clinical signs (e.g., anorexia, lethargy) were originally associated with geriatric conditions. The animal presented a large uterus, which likely further contributed to the locomotion difficulties and poor body condition. To the extent of our knowledge, this is the first report of a close pyometra in wild boar (Sus scrofa, Linnaeus, 1758). However, this diagnosis must be taken into account during uterine evaluation and special attention must be given to its inspection in meat animals.Piometra je akumulacija gnoja u lumenu maternice. U ovom radu, autori su opisali neobičan slučaj piometre u ženke divlje svinje (Sus scrofa) iz biološkog parka Parque Biologico de Gaia. (Avintes, Portugal). Životinja je bila već stara, a vidljivi klinički znaci (npr. anoreksija, letargija) izvorno su pripisani gerijatrijskom stanju. Životinja je imala veliku maternicu, koja je vjerojatno doprinijela poteškoćama u kretanju i lošim stanjem organizma. Prema saznanjima autora, ovo je prvi prikaz slučaja o zatvorenoj piometri u divlje svinje (Sus scrofa, Linnaeus, 1758.). Ovu je dijagnozu potrebno uzeti u obzir prilikom procjene maternice i posebnu bi pozornost trebalo posvetiti njezinom ispitivanju u životinja koje se koriste u ishrani ljudi

Antagonistas adenosinérgicos revertem prejuízos cognitivos em modelo animal do transtorno de déficit de atenção

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia.O transtorno de déficit de atenção e hiperatividade (TDAH) é um dos transtornos psiquiátricos mais comuns em crianças e adolescentes, afetando cerca de 2 a 12% das crianças em idade escolar. A linhagem de ratos espontaneamente hipertensos (SHR) tem sido utilizada como principal modelo animal para o estudo deste transtorno, já que estes animais apresentam características comportamentais (hiperatividade, impulsividade e prejuízo atencional) e neuroquímicas semelhantes às observadas neste transtorno em humanos. Trabalhos recentes demonstraram que a administração de cafeína, um antagonista adenosinérgico não seletivo, reverteu os prejuízos apresentados pelos ratos SHR nas tarefas de aprendizado espacial e de memória social. Sendo assim o objetivo do presente estudo foi caracterizar o prejuízo apresentado por ratos SHR machos e fêmeas na tarefa de reconhecimento de objetos quando comparados aos ratos Wistar (WIS). Investigamos ainda o efeito agudo do metilfenidato, cafeína e de antagonistas seletivos de receptores adenosinérgicos na idade adulta e também o efeito da administração repetida de metilfenidato e cafeína na idade adulta ou durante a adolescência. Os resultados demonstraram que os ratos WIS discriminam todos os objetos apresentados, enquanto que os ratos SHR discriminam apenas os objetos com grandes diferenças estruturais. Foi também observado que o tratamento intraperitoneal com metilfenidato (2 mg/kg), cafeína (1-10 mg/kg), antagonistas adenosinérgicos seletivos para receptores A1 - DPCPX (5 mg/kg), antagonistas adenosinérgicos seletivos para receptores A2A - ZM241385 (1 mg/kg) e também a associação de doses não efetivas de DPCPX (3 mg/kg) + ZM241385 (0,5 mg/kg) na idade adulta reverteram o prejuízo apresentado pelos ratos SHR na tarefa de reconhecimentos de objetos, sem alterar a atividade locomotora ou a hipertensão apresentada por esses animais. Além disso, o tratamento repetido de metilfenidato (2 mg/kg) ou cafeína (3 mg/kg) durante a idade adulta ou durante a adolescência reverteram de forma persistente o prejuízo apresentado nesta tarefa pelos ratos SHR, no entanto a administração de ambas as drogas durante a adolescência causou prejuízo na capacidade discriminatória dos ratos WIS quando testados na idade adulta. Surpreendentemente não ocorreram diferenças entre as linhagens, na expressão de receptores adenosinérgicos do subtipo A1 e A2A avaliada através da técnica de imuno-histoquímica. Estes resultados sugerem que o desempenho dos ratos SHR na tarefa de reconhecimento de objetos parece estar relacionado com prejuízos no aprendizado discriminatório, aos déficits atencionais e não com a capacidade de armazenar informações. O presente estudo demonstra também que os antagonistas seletivos e não seletivos de receptores adenosinérgicos revertem o prejuízo apresentado pelos ratos SHR, sendo que os efeitos da administração repetida destas drogas podem persistir mesmo após o termino do tratamento, sugerindo assim o potencial destas drogas para o tratamento dos prejuízos cognitivos associados ao TDAH. Attention deficit hyperactivity disorder (ADHD) is one of the most common childhood psychiatric disorders, affecting between 2 and 12% of primary-school children. The spontaneously hypertensive rat (SHR) is considered a genetic model for the study of this disorder since it displays behavioral and neurochemical characteristics of ADHD. Recent studies demonstrated that administration of the non selective adenosine receptor antagonist caffeine improved memory impairments in SHR rats. Therefore the objective of this study was to investigate whether adult male and female SHR exhibit altered short-term object recognition abilities compared to Wistar rats (WIS). The acute effects of methylphenidate, caffeine, or selective adenosine receptor antagonists in the performance of adults WIS and SHR rats in the object recognition task and the effects of repeated administration of methylphenidate and caffeine in adult age and adolescence were also evaluated. The results show that WIS rats displayed discrimination ability for all the objects employed while, SHR only discriminated #distinct# pairs of objects, they were not able to discriminate pairs of objects with subtle structural differences. In addition, the acute intraperitoneal (i.p.) injection of methylphenidate (2 mg/kg), caffeine (1#10 mg/kg), the selective adenosine A1 receptor antagonist DPCPX (5 mg/kg), the selective adenosine A2A receptor antagonist ZM241385 (1.0 mg/kg) or association with low doses with DPCPX (3 m/kg) and ZM242385 (0,5 mg/kg), reversed the impairment of object recognition in SHR, without altering the locomotion or hypertensive state. The repeated treatment with methylphenidate (2 mg/kg) and caffeine (3 mg/kg) in the adult age or in adolescence improved the object recognition deficits in the SHR rats. However, in WIS rats these treatments during adolescence impaired the recognition task. Interestingly, no major differences in the immunoreactivity of adenosine A1 and A2A receptors were observed in brain areas of WIS and SHR rats. These findings suggest that the previously described inability of SHR in cognitive paradigm may not be associated with their capacity to store information for short-term periods but rather may reflect discriminative learning impairments associated with attentional deficits. The present work also shows that selective and non selective adenosine receptors antagonists improved the cognitive impairment in SHR rats. Moreover, the effects of repeated administration of these drugs were persistent after the end of treatment, suggesting the potential of adenosinergic drugs for the treatment of cognitive impairment associated to ADHD