Interactions between Bacteria and Bile Salts in the Gastrointestinal and Hepatobiliary Tracts

Bile salts and bacteria have intricate relationships. The composition of the intestinal pool of bile salts is shaped by bacterial metabolism. In turn, bile salts play a role in intestinal homeostasis by controlling the size and the composition of the intestinal microbiota. As a consequence, alteration of the microbiome–bile salt homeostasis can play a role in hepatic and gastrointestinal pathological conditions. Intestinal bacteria use bile salts as environmental signals and in certain cases as nutrients and electron acceptors. However, bile salts are antibacterial compounds that disrupt bacterial membranes, denature proteins, chelate iron and calcium, cause oxidative damage to DNA, and control the expression of eukaryotic genes involved in host defense and immunity. Bacterial species adapted to the mammalian gut are able to endure the antibacterial activities of bile salts by multiple physiological adjustments that include remodeling of the cell envelope and activation of efflux systems and stress responses. Resistance to bile salts permits that certain bile-resistant pathogens can colonize the hepatobiliary tract, and an outstanding example is the chronic infection of the gall bladder by Salmonella enterica. A better understanding of the interactions between bacteria and bile salts may inspire novel therapeutic strategies for gastrointestinal and hepatobiliary diseases that involve microbiome alteration, as well as novel schemes against bacterial infectionsEspaña, MINECO BIO2013-44220-

Host-pathogen interactions in typhoid fever: the model is the message

Spanish Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO) and the European Regional Fund PCIN-2015-131 (Infect-ERA) and BIO2016-75235-

Bile resistance mechanisms in salmonella enterica: genetic and molecular analysis

Este trabajo centra su investigación en las respuestas adaptativas de Salmonella enterica frente a situaciones de estrés. S. enterica tiene un ciclo de vida complejo y es capaz de sobrevivir y crecer en numerosos ambientes que incluyen, entre otros, una variedad de hospedadores animales así como múltiples entornos naturales. La versatilidad de esta especie bacteriana viene dada por su capacidad de desencadenar una respuesta apropiada a la variedad de señales ambientales que puede encontrar. Muchos de estos ambientes producen estreses a la bacteria en forma de limitación de nutrientes; pH, temperatura y osmolaridad inestables; desecación; exposición a péptidos antimicrobianos, bilis, agentes oxidantes, etc. Nuestra investigación está enfocada en la respuesta de la bacteria frente al estrés generado por exposición a bilis, una secreción digestiva con propiedades antimicrobianas. Durante su ciclo de infección, S. enterica entra en contacto con bilis en el intestino. La bilis es una secreción compleja, que tiene diversas funciones en la fisiología de los mamíferos. Sirve para la dispersión y absorción de lípidos durante la digestión, siendo secretada por la vesícula en el momento de ingestión de alimentos. La bilis también sirve para eliminar el exceso de colesterol y otros productos del metabolismo hepático. Adicionalmente, las sales biliares poseen potentes propiedades antimicrobianas: actúan como detergentes en la membrana lipídica, desnaturalizan proteínas y causan daños en el ADN, destruyendo la homeostasis bacteriana. Debido a estas propiedades, la capacidad de la flora intestinal y los patógenos entéricos para tolerar la bilis es muy importante para su supervivencia. En Salmonella, es igualmente importante para la subsecuente colonización del hospedador. Existen tres grandes mecanismos de resistencia a sales biliares en S. enterica. La primera barrera la constituye la envoltura celular, una estructura compleja con propiedades hidrofóbicas frente a múltiples sustancias antibacterianas incluyendo las sales biliares. La mayoría de los componentes de la envolura que proporcionan resistencia a bilis están en la cara externa de la envoltura celular, principalmente en el lipopolisacárido (LPS). Si las sales biliares logran penetrar en el citoplasma de la bacteria, el segundo mecanismo se activa: las bombas de vertido, que expulsan todo tipo de compuestos nocivos de la célula (incluyendo sales biliares, antibióticos, solventes, etc.). El último nivel de resistencia a sales biliares lo constituyen los mecanismos de evitación de daño a proteínas y a ADN, y los mecanismos de reparación de ADN. Un fenómeno de gran complejidad que tiene un papel importante en la resistencia a bilis por parte de S. enterica es la adaptación. Consiste en el aumento de la resistencia a bilis tras la exposición a una dosis subletal. Dicha resistencia, que permite sobrevivir a concentraciones letales de sales biliares, es reversible y desaparece una vez que la bacteria vuelve a encontrarse en ausencia de bilis. Aunque se conoce que la adaptación implica cambios en la expresión génica, aún sigue siendo un mecanismo poco entendido. Para identificar las funciones celulares esenciales para la adaptación a bilis, mutantes con fenotipos sensibles a bilis fueron sometidos a ensayos de adaptación. De este modo se observó que la bomba de vertido AcrAB parecía tener un papel esencial en la la adaptación a bilis. Un escrutinio genético en un mutante acrA determinó que únicamente el incremento de expresión de diferentes bombas de vertido podía restaurar parcialmente los niveles de resistencia a bilis en dicho mutante. Estos resultados llevaron a obtener múltiples mutantes carentes de de bombas de vertido y a estudiar su papel en la resistencia a bilis. La conclusión fue que, a pesar de que se ha indicado que existen 5 bombas de vertido que tienen sales biliares como sustrato, únicamente AcrAB era relevante. Estudios moleculares del proceso de adaptación mostraron que el primer contacto de cultivos de S. enterica en fase exponencial con sales biliares (DOC) conlleva un incremento de la expresión de acrAB. A su vez, estudios de citometría de flujo demostraron que en esta fase de crecimiento AcrAB permanece activa independientemente de la presencia de DOC. En fase estacionaria, la presencia de DOC no aumenta la expresión de acrAB pero activa el vertido por parte de esta bomba. Estas observaciones sugieren que la activación de la expresión de acrAB puede ser crucial durante las primeras etapas de adaptación, mientras que en fase estacionaria la actividad sostenida de estas bombas es suficiente para lograr elevados niveles de resistencia a bilis. Estudios de mecanismos de resistencia a bilis in vivo, utilizando ratones BALB/c como modelo de fiebre tifoidea, llevaron a la conclusión de que la colonización de la vesícula biliar depende principalmente del proceso de adaptación a bilis de S. enterica. Esta conclusión se obtuvo al observar que en la gran mayoría de aislados de la vesícula la resistencia a bilis desaparecía una vez que dichos aislados eran cultivados en un medio libre de sales biliares. Sin embargo, también se obtuvieron algunos aislados con resistencia estable, que fueron considerados mutantes. Los genomas de algunos de dichos aislados fueron secuenciados. Los resultados confirman que la envoltura celular bacteriana es la principal estructura mediadora de resistencia a bilis en S. enterica: la mayoría de aislados presentaban mutaciones en genes relacionados con las membranas, la división celular, el transporte, la síntesis de LPS, etc. Debido a las implicaciones médicas que puede tener la resistencia a bilis de S. enterica, el estudio de los mecanismos de interacción bacteria--‐bilis presentado en esta Tesis puede contribuir a desarrollar nuevos enfoques terapéuticos para erradicar la infección crónica de la vesícula biliar por parte de Salmonella, que constituye un serio problema sanitario en determinadas regiones del planeta

Adaptation of Salmonella enterica to bile: essential role of AcrAB-mediated efflux

Adaptation to bile is the ability to endure the lethal effects of bile salts after growth on sublethal concentrations. Surveys of adaptation to bile in Salmonella enterica ser. Tyhimurium reveal that active efflux is essential for adaptation while other bacterial functions involved in bile resistance are not. Among S. enterica mutants lacking one or more efflux systems, only strains lacking AcrAB are unable to adapt, thus revealing an essential role for AcrAB. Transcription of the acrAB operon is upregulated in the presence of a sublethal concentration of sodium deoxycholate (DOC) while other efflux loci are either weakly upregulated or irresponsive. Upregulation of acrAB transcription is strong during exponential growth, and weak in stationary cultures. Single cell analysis of ethidium bromide accumulation indicates that DOC-induced AcrAB-mediated efflux occurs in both exponential and stationary cultures. Upregulation of acrAB expression may thus be crucial at early stages of adaptation, while sustained AcrAB activity may be sufficient to confer bile resistance in nondividing cells.Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO) de España y el Fondo Regional Europeo (FEDER) BIO2013–44220-R y BIO2016–75235-PConsejería de Innovación, Ciencia y Empresa, Junta de Andalucía. CVI-587

Evidence for Involvement of the Salmonella enterica Z-Ring Assembly Factors ZapA and ZapB in Resistance to Bile

Genes annotated as ygfE and yiiU in the genome of Salmonella enterica serovar Typhimurium encode proteins homologous to Escherichia coli cell division factors ZapA and ZapB, respectively. ZapA− and ZapB− mutants of S. enterica are bile-sensitive. The amount of zapB mRNA increases in the presence of a sublethal concentration of sodium deoxycholate (DOC) while zapA mRNA remains unaffected. Increased zapB mRNA level in the presence of DOC is not caused by upregulation of zapB transcription but by increased stability of zapB mRNA. This increase is suppressed by an hfq mutation, suggesting the involvement of a small regulatory RNA. We provide evidence that such sRNA is MicA. The ZapB protein is degraded in the presence of DOC, and degradation appears to involve the Lon protease. We propose that increased stability of zapB mRNA in the presence of DOC may counter degradation of bile-damaged ZapB, thereby providing sufficient level of functional ZapB protein to permit Z-ring assembly in the presence of bile.España , Ministerio de Economía, Industria y Competitividad BIO2016-75235-