Detección de ácido pirazinoico como biomarcador de resistencia a pirazinamida en Mycobacterium tuberculosis mediante dos inmunoensayos empleando nanopartículas magnéticas, tmRNA y RpsA

Diseña un sistema que detecte al ácido pirazinoico (POA), el cual es producto del metabolismo de la bacteria y principio activo de la droga. Cuando una bacteria es sensible al tratamiento con pirazinamida, produce POA en los cultivos a determinado ratio, sin embargo, aquellas resistentes no producen o producen muy poco. Se logró ensamblar dos sistemas de detección, el Sistema I consistió en acoplar la proteína RpsA y su tmRNA a una nanopartícula magnética de estreptavidina a través del tmRNA biotinilado, mientras que el Sistema II, consistió en acoplar las mismas moléculas a una nanopartícula magnética de cobalto, pero a través de la cola de histidinas de la proteína RpsA. Estos sistemas fueron enfrentados de forma preliminar, a POA comercial. Como resultado se obtuvo que el primer sistema logró detectar hasta cinco picomoles del ácido, sin embargo, estos resultados no lograron ser reproducibles. El segundo sistema logró detectar hasta 750 picomoles del ácido, y se logró reproducir en dos ocasiones. Los sistemas fueron estables y demostraron estar ensamblados correctamente, sin embargo, la variabilidad en los resultados de detección de POA, aquí presentados, estarían indicando que la interacción entre el RpsA y el POA no es tan fuerte como se mencionó en estudios anteriores. El resultado de este trabajo estaría confirmando lo reportado en un último estudio publicado en Nature, el cual refuta la hipótesis de que el ácido pirazinoico se une a RpsA con gran afinidad.Innóvate PerúTesi

Implementación y establecimiento de un punto de corte en un test de Wayne cuantitativo para detectar la susceptibilidad a PZA en cultivos MODS de muestras de esputo

La pirazinamida (PZA) es una droga importante para el acortamiento del tratamiento antituberculoso, es la única que actúa sobre las micobacterias latentes. La susceptibilidad a PZA puede ser determinada evaluando: el crecimiento de la micobacteria frente a la droga (BACTEC 960), la actividad enzimática de la pirazinamidasa (PZAsa) (Test de Wayne) que detecta al ácido pirazinoico (POA) o molecularmente, identificando variantes o mutaciones presentes en el gen pncA que puede afectar su actividad normal. BACTEC MGIT960 ha sido la única prueba de susceptibilidad (DST) recomendada por la OMS, sin embargo, ha reportado alto índice de falsos resistentes, quizás por la dificultad de mantener un pH adecuado y controlar el inóculo cultivado. El secuenciamiento conlleva un alto costo y, además, un cierto porcentaje de mutaciones puede no afectar la actividad enzimática, o cepas WT manifiestan resistencia, por lo que hay otros mecanismos que estarían implicados en la resistencia. En este estudio planteamos cuantificar la producción de POA en cultivo líquido directamente de esputo luego de su incubación con PZA (MODS-WQ), a diferencia del test de Wayne convencional que se basa en la observación del color. Se usaron 264 muestras de esputo de pacientes con tuberculosis y se evaluó dos variantes del medio: caldo 7H9 y buffer citrato, ambas a pH neutral. La variante en buffer citrato identificó correctamente el 92.6% de los aislados resistentes y el 95.6% de los aislados sensibles, usando como gold estándar las tres DST mencionadas. La variante en 7H9 identificó 81.3% resistentes y 77.2% sensibles. Los resultados se obtuvieron en un promedio de 13 días.Pyrazinamide (PZA) is an important drug for shortening anti-tuberculosis treatment as it is the only one that acts on latent mycobacteria. Susceptibility to PZA can be determined by evaluating the growth of mycobacteria against the drug (BACTEC 960), the enzymatic activity of pyrazinamidase (PZAsa) through the Wayne Test, which detects pyrazinoic acid (POA) or molecularly, identifying variants or mutations present in the pncA gene that can affect its normal activity. The BACTEC MGIT960 has been the only susceptibility test recommended by the WHO, however, it has reported a high rate of false resistance, perhaps due to the difficulty of maintaining an adequate pH and controlling the amount of cultured inoculum. Sequencing carries a high cost, and, in addition, a certain percentage of mutations may not affect their enzymatic activity, or WT strains show resistance, so there are some mechanisms that are not well studied that would be involved in resistance. In this study we propose to quantify the production of POA in liquid culture directly from sputum after its incubation with PZA (MODS-WQ), unlike the conventional Wayne test that is based on the observation of color. 264 sputum samples from tuberculosis patients were used to evaluate two medium variants: 7H9 broth and citrate buffer, both at neutral pH. The variant in citrate buffer correctly identified 92.6% of the resistant isolates and 95.6% of the sensitive isolates, using the three mentioned DSTs as the gold standard. The 7H9 variant identified 81.3% resistant and 77.2% sensitive. Results were obtained in an average of 13 days

Efecto irritante in vitro de formulaciones cosméticas con extracto de camu camu, mediante el método Het Cam.

OBJETIVOEvaluar el efecto irritante de formulaciones cosméticas con extractos de camu camu.MATERIAL Y MÉTODOEl presente estudio se realizó con formulaciones cosméticas de extractos de camu camu, proporcionadas por el Laboratorio de AYRU COSMETIC; utilizamos la técnica alternativa in vitro, en membrana corioalantoidea en huevos fértiles de gallina (HET CAM, hen´s egg test chorioallantoic membrane). La implementación de la técnica se realizó en el Centro de Investigación de Medicina Tradicional y Farmacología del Instituto de Investigación de la Facultad de Medicina Humana de la USMP.RESULTADOSNinguno de los cosméticos con extracto de camu camu, produjo ruptura de la membrana corioalantoidea, evidenciado por ausencia del colorante absorbido, azul de tripán, detectable a 595 nm.CONCLUSIONESLos índices de irritación (I.I) obtenidos en todas las formulaciones cosméticas permiten clasificarlas como NO IRRITANTES, y constituyen el soporte de la inocuidad, de las mismas, para continuar con pruebas de eficacia clínica. (Horiz Med 2013; 13(2): 12-18)

Mechanisms of androgen metabolism reprogramming in aggressive prostate cancer models and the association between androgens and COVID-19

El funcionament adequat del sistema endocrí desempenya un paper crucial en el manteniment de la salut humana, ja que les hormones són essencials per regular la homeòstasi del cos. Les interrupcions en les vies normals de senyalització hormonal poden portar a diverses malalties, comprometent la resposta immunològic i contribuint a amb el càncer a nivell cel·lular, com la proliferació cel·lular, la migració, la invasió i la formació de metàstasis. Inicialment, la nostra tesi tenia com a objectiu investigar el paper de les hormones esteroides en el càncer de pròstata. No obstant això, a causa de la pandèmia, vam ampliar el nostre enfocament per estudiar les hormones masculines en la COVID-19. El càncer de pròstata és dependent d'hormones i la teràpia de privació d'andrògens (ADT) és el tractament estàndard per a tumors no operables. Desafortunadament, la resistència a l'ADT continua sent un desafiament significatiu, sovint atribuït a la biosíntesi intratumoral d'hormones. Per comprendre millor aquests mecanismes, vam utilitzar cultius primaris de pacients sense exposició prèvia a hormones (hnPCs) amb tumors agressius. La nostra anàlisi va revelar canvis importants en aquests cultius, que van afectar les vies dels andrògens (AR, SRD5A1, AKR1C3, PAPSS2), les vies dels estrògens (ESRRA, CYP1B1, CYP19A1) i la via p53 (TP53, MDM2, CDKN1A), demostrant que aquests models experimenten una reprogramació metabòlica per augmentar la producció d'hormones esteroides. Destacablement, vam observar una forta sobreexpressió de CDKN1A p21WAF1, que va estar significativament associada a AKR1C3 i altres gens esteroidogènics, insinuant un possible paper oncogènic per a p21WAF1. Anàlisis addicionals van revelar la localització nuclear de p21 i l'expressió de marcadors de senescència; no obstant això, les hnPCs mostren una proliferació moderada però sostinguda, alta quimiorresistència intrínseca i expressió de marcadors de cèl·lules mare canceroses. Estudis actuals han revelat el paper paradògic de la senescència, demostrant que pot promoure la progressió i l'agressivitat del càncer. Per tant, els nostres resultats mostren evidències d'un estat similar a la senescència en aquests cultius, que pot promoure la reprogramació metabòlica i l'agressivitat en el càncer de pròstata. Els casos greus de la COVID-19 es relacionen amb factors com l'edat avançada, el sexe masculí, l'estatus socioeconòmic i les comorbiditats. La nostra recerca va aprofundir en la relació entre els nivells sèrics de testosterona, els perfils de cèl·lules immunològiques i la gravetat de la malaltia en pacients masculins amb la COVID-19. Vam identificar diferències significatives en els predictors bioquímics de la malaltia entre pacients masculins i femenins. L'anàlisi longitudinal va revelar que les trajectòries dels nivells sèrics de testosterona eren els predictors més forts de la supervivència entre tots els paràmetres bioquímics estudiats, fins i tot superant els valors únics de testosterona en l'admissió. En casos que van portar a la mort, vam observar patrons irregulars en els nivells sèrics de la hormona luteïnitzant (LH) i l'androstenediona, suggerint una incapacitat per restablir els nivells normals de testosterona. Aquest fenomen va estar associat amb una diferenciació deficient de les cèl·lules T auxiliars i un augment dels monocits clàssics circulants, indicant la influència significativa de l'estat de testosterona en les respostes immunitàries a la COVID-19.El adecuado funcionamiento del sistema endocrino desempeña un papel crucial en el mantenimiento de la salud humana, ya que las hormonas son esenciales para regular la homeostasis. Las interrupciones en las vías normales de señalización hormonal pueden llevar a diversas enfermedades, comprometiendo la respuesta inmune o contribuyendo a con el cáncer a nivel celular, como la proliferación celular, la migración, la invasión y la formación de metástasis. Inicialmente, nuestra tesis tenía como objetivo investigar el papel de las hormonas esteroides en el cáncer de próstata. Sin embargo, debido a la pandemia, ampliamos nuestro enfoque para estudiar las hormonas masculinas en la COVID-19. El cáncer de próstata es dependiente de hormonas y la terapia de privación de andrógenos (ADT) es el tratamiento estándar para tumores no operables. Desafortunadamente, la resistencia al ADT sigue siendo un desafío, a menudo atribuido a la síntesis intratumoral de hormonas. Para comprender mejor estos mecanismos, utilizamos cultivos primarios de pacientes con tumores agresivos homone-naive (hnPCs). Nuestro análisis reveló cambios sustanciales en los cultivos, que afectaron las vías de andrógenos (AR, SRD5A1, AKR1C3, PAPSS2), las vías de los estrógenos (ESRRA, CYP1B1, CYP19A1) y la vía p53 (TP53, MDM2, CDKN1A), demostrando que estos modelos experimentan una reprogramación metabólica para aumentar la producción de hormonas esteroides. Notablemente, observamos una fuerte sobreexpresión de CDKN1A (p21WAF1), que estuvo significativamente asociada a AKR1C3 y otros genes esteroidogénicos, insinuando un posible papel oncogénico para p21WAF1. Análisis adicionales revelaron la localización nuclear de p21WAF1 y la expresión de marcadores de senescencia; sin embargo, los hnPCs muestran una proliferación moderada pero sostenida, alta quimiorresistencia y expresión de marcadores de stemness. Estudios actuales han revelado el papel paradójico de la senescencia, demostrando que puede promover la progresión y agresividad del cáncer. Por lo tanto, nuestros resultados muestran evidencia de un estado similar a la senescencia en estos cultivos, que puede promover la reprogramación metabólica y la agresividad en el cáncer de próstata. Los casos graves de COVID-19 se asocian con factores como la edad, el sexo masculino y las comorbilidades. Nuestra investigación profundizó en la relación entre los niveles séricos de testosterona, los perfiles de células inmunológicas y la gravedad de la enfermedad en pacientes hombres con COVID-19. Identificamos diferencias significativas en los predictores bioquímicos de la enfermedad entre pacientes hombres y mujeres. El análisis longitudinal reveló que las trayectorias de los niveles séricos de testosterona fueron los predictores más sólidos de la supervivencia entre todos los parámetros bioquímicos estudiados, incluso superando los valores únicos de testosterona en la admisión. En los casos fatales, observamos patrones irregulares en los niveles séricos de hormona luteinizante (LH) y androstenediona, lo que sugiere una incapacidad para restablecer los niveles normales de testosterona. Este fenómeno se asoció con una diferenciación deficiente de las células T auxiliares y un aumento de los monocitos clásicos circulantes, lo que indica la influencia significativa del estado de testosterona en las respuestas inmunológicas a la COVID-19.The proper functioning of the endocrine system plays a crucial role in maintaining human health, as hormones are vital for regulating bodily homeostasis. Disruptions in normal hormone signaling pathways can lead to various diseases, compromising the immune system's response to infections and contributing to cancer-related behaviors at the cellular level, including cell proliferation, migration, invasion, and metastasis formation. Initially, our thesis aimed to investigate the role of steroid hormones in prostate cancer. However, due to the pandemic, we expanded our focus to study male hormones in COVID-19. Prostate cancer is hormone-dependent, and androgen deprivation therapy (ADT) is the standard treatment for inoperable tumors. Unfortunately, resistance to ADT remains a significant challenge, often attributed to intratumor hormone biosynthesis. To better understand these mechanisms, we utilized primary cultures from hormone-naïve patients (hnPCs) with aggressive tumors. Our analysis revealed substantial changes in these cultures, impacting androgen pathways (AR, SRD5A1, AKR1C3, PAPSS2), estrogen pathways (ESRRA, CYP1B1, CYP19A1), and the p53 pathway (TP53, MDM2, CDKN1A). demonstrating that these models are undergoing a metabolic reprogramming in order to enhance the production of steroid hormones. Notably, we observed a strong overexpression of CDKN1A(p21WAF1), which was significantly associated with AKR1C3 and other steroidogenic genes, hinting at a potential oncogenic role for p21WAF1. Further analyses revealed nuclear localization of p21WAF1 and the expression of senescence markers, however, hnPCs show moderate but sustained proliferation, high intrinsic chemoresistance and expression of cancer stem markers. Current studies have revealed the paradoxical role of senescence, demonstrating that it can promote cancer progression and aggressiveness. Therefore, our results show evidence of a senescence-like state in these cultures, which may promote metabolic reprogramming and aggressiveness in prostate cancer. Severe COVID-19 cases are associated with factors such as old age, male sex, socioeconomic status, and comorbidities. Our research delved into the link between serum testosterone levels, immune cell profiles, and disease severity in male COVID-19 patients. We identified significant differences in biochemical predictors of disease outcomes between male and female patients. Longitudinal analysis revealed that serum testosterone trajectories were the strongest predictors of survival among all biochemical parameters studied, even surpassing single-point admission serum testosterone values. In cases leading to fatalities, we observed irregular patterns in serum luteinizing hormone (LH) and androstenedione levels, suggesting a failure to restore normal testosterone levels. This phenomenon was associated with impaired T helper differentiation and increased circulating classical monocytes, indicating the substantial influence of testosterone status on immune responses to COVID-19.Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Bioquímica, Biologia Molecular i Biomedicin

Mechanisms of androgen metabolism reprogramming in aggressive prostate cancer models and the association between androgens and COVID-19

El funcionament adequat del sistema endocrí desempenya un paper crucial en el manteniment de la salut humana, ja que les hormones són essencials per regular la homeòstasi del cos. Les interrupcions en les vies normals de senyalització hormonal poden portar a diverses malalties, comprometent la resposta immunològic i contribuint a amb el càncer a nivell cel·lular, com la proliferació cel·lular, la migració, la invasió i la formació de metàstasis. Inicialment, la nostra tesi tenia com a objectiu investigar el paper de les hormones esteroides en el càncer de pròstata. No obstant això, a causa de la pandèmia, vam ampliar el nostre enfocament per estudiar les hormones masculines en la COVID-19. El càncer de pròstata és dependent d'hormones i la teràpia de privació d'andrògens (ADT) és el tractament estàndard per a tumors no operables. Desafortunadament, la resistència a l'ADT continua sent un desafiament significatiu, sovint atribuït a la biosíntesi intratumoral d'hormones. Per comprendre millor aquests mecanismes, vam utilitzar cultius primaris de pacients sense exposició prèvia a hormones (hnPCs) amb tumors agressius. La nostra anàlisi va revelar canvis importants en aquests cultius, que van afectar les vies dels andrògens (AR, SRD5A1, AKR1C3, PAPSS2), les vies dels estrògens (ESRRA, CYP1B1, CYP19A1) i la via p53 (TP53, MDM2, CDKN1A), demostrant que aquests models experimenten una reprogramació metabòlica per augmentar la producció d'hormones esteroides. Destacablement, vam observar una forta sobreexpressió de CDKN1A p21WAF1, que va estar significativament associada a AKR1C3 i altres gens esteroidogènics, insinuant un possible paper oncogènic per a p21WAF1. Anàlisis addicionals van revelar la localització nuclear de p21 i l'expressió de marcadors de senescència; no obstant això, les hnPCs mostren una proliferació moderada però sostinguda, alta quimiorresistència intrínseca i expressió de marcadors de cèl·lules mare canceroses. Estudis actuals han revelat el paper paradògic de la senescència, demostrant que pot promoure la progressió i l'agressivitat del càncer. Per tant, els nostres resultats mostren evidències d'un estat similar a la senescència en aquests cultius, que pot promoure la reprogramació metabòlica i l'agressivitat en el càncer de pròstata. Els casos greus de la COVID-19 es relacionen amb factors com l'edat avançada, el sexe masculí, l'estatus socioeconòmic i les comorbiditats. La nostra recerca va aprofundir en la relació entre els nivells sèrics de testosterona, els perfils de cèl·lules immunològiques i la gravetat de la malaltia en pacients masculins amb la COVID-19. Vam identificar diferències significatives en els predictors bioquímics de la malaltia entre pacients masculins i femenins. L'anàlisi longitudinal va revelar que les trajectòries dels nivells sèrics de testosterona eren els predictors més forts de la supervivència entre tots els paràmetres bioquímics estudiats, fins i tot superant els valors únics de testosterona en l'admissió. En casos que van portar a la mort, vam observar patrons irregulars en els nivells sèrics de la hormona luteïnitzant (LH) i l'androstenediona, suggerint una incapacitat per restablir els nivells normals de testosterona. Aquest fenomen va estar associat amb una diferenciació deficient de les cèl·lules T auxiliars i un augment dels monocits clàssics circulants, indicant la influència significativa de l'estat de testosterona en les respostes immunitàries a la COVID-19.El adecuado funcionamiento del sistema endocrino desempeña un papel crucial en el mantenimiento de la salud humana, ya que las hormonas son esenciales para regular la homeostasis. Las interrupciones en las vías normales de señalización hormonal pueden llevar a diversas enfermedades, comprometiendo la respuesta inmune o contribuyendo a con el cáncer a nivel celular, como la proliferación celular, la migración, la invasión y la formación de metástasis. Inicialmente, nuestra tesis tenía como objetivo investigar el papel de las hormonas esteroides en el cáncer de próstata. Sin embargo, debido a la pandemia, ampliamos nuestro enfoque para estudiar las hormonas masculinas en la COVID-19. El cáncer de próstata es dependiente de hormonas y la terapia de privación de andrógenos (ADT) es el tratamiento estándar para tumores no operables. Desafortunadamente, la resistencia al ADT sigue siendo un desafío, a menudo atribuido a la síntesis intratumoral de hormonas. Para comprender mejor estos mecanismos, utilizamos cultivos primarios de pacientes con tumores agresivos homone-naive (hnPCs). Nuestro análisis reveló cambios sustanciales en los cultivos, que afectaron las vías de andrógenos (AR, SRD5A1, AKR1C3, PAPSS2), las vías de los estrógenos (ESRRA, CYP1B1, CYP19A1) y la vía p53 (TP53, MDM2, CDKN1A), demostrando que estos modelos experimentan una reprogramación metabólica para aumentar la producción de hormonas esteroides. Notablemente, observamos una fuerte sobreexpresión de CDKN1A (p21WAF1), que estuvo significativamente asociada a AKR1C3 y otros genes esteroidogénicos, insinuando un posible papel oncogénico para p21WAF1. Análisis adicionales revelaron la localización nuclear de p21WAF1 y la expresión de marcadores de senescencia; sin embargo, los hnPCs muestran una proliferación moderada pero sostenida, alta quimiorresistencia y expresión de marcadores de stemness. Estudios actuales han revelado el papel paradójico de la senescencia, demostrando que puede promover la progresión y agresividad del cáncer. Por lo tanto, nuestros resultados muestran evidencia de un estado similar a la senescencia en estos cultivos, que puede promover la reprogramación metabólica y la agresividad en el cáncer de próstata. Los casos graves de COVID-19 se asocian con factores como la edad, el sexo masculino y las comorbilidades. Nuestra investigación profundizó en la relación entre los niveles séricos de testosterona, los perfiles de células inmunológicas y la gravedad de la enfermedad en pacientes hombres con COVID-19. Identificamos diferencias significativas en los predictores bioquímicos de la enfermedad entre pacientes hombres y mujeres. El análisis longitudinal reveló que las trayectorias de los niveles séricos de testosterona fueron los predictores más sólidos de la supervivencia entre todos los parámetros bioquímicos estudiados, incluso superando los valores únicos de testosterona en la admisión. En los casos fatales, observamos patrones irregulares en los niveles séricos de hormona luteinizante (LH) y androstenediona, lo que sugiere una incapacidad para restablecer los niveles normales de testosterona. Este fenómeno se asoció con una diferenciación deficiente de las células T auxiliares y un aumento de los monocitos clásicos circulantes, lo que indica la influencia significativa del estado de testosterona en las respuestas inmunológicas a la COVID-19.The proper functioning of the endocrine system plays a crucial role in maintaining human health, as hormones are vital for regulating bodily homeostasis. Disruptions in normal hormone signaling pathways can lead to various diseases, compromising the immune system's response to infections and contributing to cancer-related behaviors at the cellular level, including cell proliferation, migration, invasion, and metastasis formation. Initially, our thesis aimed to investigate the role of steroid hormones in prostate cancer. However, due to the pandemic, we expanded our focus to study male hormones in COVID-19. Prostate cancer is hormone-dependent, and androgen deprivation therapy (ADT) is the standard treatment for inoperable tumors. Unfortunately, resistance to ADT remains a significant challenge, often attributed to intratumor hormone biosynthesis. To better understand these mechanisms, we utilized primary cultures from hormone-naïve patients (hnPCs) with aggressive tumors. Our analysis revealed substantial changes in these cultures, impacting androgen pathways (AR, SRD5A1, AKR1C3, PAPSS2), estrogen pathways (ESRRA, CYP1B1, CYP19A1), and the p53 pathway (TP53, MDM2, CDKN1A). demonstrating that these models are undergoing a metabolic reprogramming in order to enhance the production of steroid hormones. Notably, we observed a strong overexpression of CDKN1A(p21WAF1), which was significantly associated with AKR1C3 and other steroidogenic genes, hinting at a potential oncogenic role for p21WAF1. Further analyses revealed nuclear localization of p21WAF1 and the expression of senescence markers, however, hnPCs show moderate but sustained proliferation, high intrinsic chemoresistance and expression of cancer stem markers. Current studies have revealed the paradoxical role of senescence, demonstrating that it can promote cancer progression and aggressiveness. Therefore, our results show evidence of a senescence-like state in these cultures, which may promote metabolic reprogramming and aggressiveness in prostate cancer. Severe COVID-19 cases are associated with factors such as old age, male sex, socioeconomic status, and comorbidities. Our research delved into the link between serum testosterone levels, immune cell profiles, and disease severity in male COVID-19 patients. We identified significant differences in biochemical predictors of disease outcomes between male and female patients. Longitudinal analysis revealed that serum testosterone trajectories were the strongest predictors of survival among all biochemical parameters studied, even surpassing single-point admission serum testosterone values. In cases leading to fatalities, we observed irregular patterns in serum luteinizing hormone (LH) and androstenedione levels, suggesting a failure to restore normal testosterone levels. This phenomenon was associated with impaired T helper differentiation and increased circulating classical monocytes, indicating the substantial influence of testosterone status on immune responses to COVID-19