9q21.13q21.31 deletion in a patient with intellectual disability severe speech delay and and dysmorphic features a newly recognized microdeletion syndrome

The increased use of chromosomal microarray analysis has led to the identification of new microdeletion/microduplication syndromes, enabling better genotype-phenotype correlations. Interstitial deletions involving the long arm of chromosome 9 are rare but recently a microdeletion syndrome at 9q21.13 was suggested, with mental retardation, speech delay, epilepsy, autistic behaviour and moderate facial dysmorphism as the main characteristics. Here we present a male child with intellectual disability, severe speech delay, microcephaly and dysmorphic features carrying an interstitial deletion, detected by the Affymetrix Cytoscan HD microarray, of 6.56 Mb at 9q21.13q21.31 region encompassing 16 OMIM genes (arr[GRCh37] 9q21.13q21.31(76551542_83116342)x1). Among the genes in the deleted region the PRUNE2, PCSK5, RORB and TRPM6 genes are expressed in the nervous system and have been describe as being candidate genes to play a role in mental retardation or neurological disorders. Although the cohort of patients identified with deletions in this region is still small our patient phenotype partially overlaps the others described in the literature. The collection of more cases with deletion of the 9q21.13 region will help establishing a clear classification for this CNV, finding the real weight in the patient’s phenotype, delineating the genetic counseling for their families, and clearly establishing this microdeletion as a syndrome.N/

Rastreio Pré-natal não-invasivo em cffDNA: Estudo Piloto da Unidade de Citogenética do DGH do INSA

Desde que, em 1997, Dennis Lo descobriu a presença de cell-free DNA de origem fetal (cffDNA) na circulação materna muito se tem investido no desenvolvimento de testes de rastreio pré-natal não invasivo, sobretudo, para a Síndrome de Down (SD). Atualmente, encontram-se disponíveis no mercado variadíssimos testes que facultam este tipo de rastreio em cffDNA, com melhores performances de sensibilidade e especificidade, quando comparado ao rastreio pré-natal convencional. No entanto, e de acordo com a sua realidade, cada país tem optado por diferentes estratégias. A Unidade de Citogenética do Departamento de Genética Humana, do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge (INSA, IP), como Laboratório de Estado e do Serviço Nacional de Saúde, iniciou em 2016, com o apoio da Unidade de Tecnologia e Inovação do mesmo departamento, a implementação de um teste de cffDNA (NIPT) com o objectivo de disponibilizar esta opção aos Centros de Diagnóstico Pré-Natal (CDPN) nacionais. De forma a validar a metodologia e capacitar tecnicamente os elementos participantes, para a realização dos procedimentos laboratoriais necessários, testaram-se inicialmente, cerca de 60 amostras de sangue materno. Estas amostras foram colhidas em paralelo com a realização do procedimento invasivo (Liquido Amniótico ou Biópsia de Vilosidade Coriónica), de forma a ser possível comparar ambos os resultados e inferir conclusões nesta amostragem inicial. Posteriormente, foi estabelecido um protocolo, com o CDPN da Maternidade Dr. Alfredo da Costa, para a realização de um estudo piloto, ao abrigo do qual foram analisados, até ao momento, cerca de 350 NIPT. Neste trabalho propomo-nos apresentar as dificuldades sentidas na implementação desta metodologia, a sua aceitação, bem como os resultados obtidos. Pretendemos ainda lançar as bases para uma discussão sobre o seu enquadramento no SNS em Portugal e critérios para a sua implementação.N/

Caracterização molecular de produtos de recombinação ilegítima envolvendo o agrupamento génico CYP21A1P-CYP21A2 em doentes com hiperplasia supra-renal congénita

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011A hiperplasia supra-renal congénita devido à deficiência 21-hidroxilase é uma das doenças autossómicas recessivas mais comum no Homem. A 21-OHD compromete a biossíntese de cortisol, levando a um aumento dos androgénios supra-renais e consequente virilização dos genitais externos em fetos femininos. O gene codificante da 21-OH, CYP21A2, encontra-se, juntamente com o seu pseudogene (CYP21A1P), no agrupamento RCCX (6p21.3). A estrutura mais comum deste agrupamento compreende os seguintes genes: Telómero-5’-RP1-C4A-CYP21A1P-TNXA-RP2-C4B-CYP21A2-TNXB-3’-Centrómero. Uma caracterização molecular completa e segura de 21-CAH requer não só uma estratégia que permita a detecção de variações na sequência do gene CYP21A2 mas também metodologias que permitam a detecção de variações no número de cópias do gene, conversões e quimeras. Para a detecção destas alterações estruturais e numéricas envolvendo o gene CYP21A2 e o pseudogene CYP21A1P, o Shouthern-blotting foi a técnica mais utilizada até recentemente. Apesar desta metodologia permitir a detecção das referidas alterações no agrupamento RCCX é uma técnica trabalhosa e morosa que requer grandes quantidades de DNA e implica o uso de radioactividade. Para além disso esta não permite a caracterização da extensão de conversões ou quimeras. Este trabalho avalia o uso de MLPA (Multiplex ligation-dependent probe amplification), uma técnica recente para avaliação do número de cópias de genes, no estudo de alelos recombinantes no agrupamento RCCX, em particular aqueles envolvendo o gene CYP21A2 e o pseudogene CYP21A1P, salientando as possibilidades e limitações desta técnica especialmente numa perspectiva de diagnóstico molecular da 21-CAH. Neste estudo foram caracterizados molecularmente, por recurso a MLPA e outras técnicas moleculares, um total de 200 alelos: 94 alelos com alterações estruturais e/ou numéricas envolvendo os gene CYP21A2 e/ou CYP21A1P (38 duplicações, 17 delecções, 20 macroconversões, 19 quimeras), 43 alelos bimodulares com mutações pontuais em CYP21A2 e 63 alelos normais. De entre os alelos estudados este trabalho reporta um indivíduo que apresenta características fenotípicas de 21-OHD, homozigótico para o alelo com duplicação de CYP21A2 com a cópia proximal ao centrómero mutada. Este caso poderá contribuir para o esclarecimento da presente controvérsia sobre a funcionalidade das cópias duplicadas de CYP21A2. Finalmente, é descrito um caso único de um alelo com uma delecção extensa desde o intrão 9 de CYP21A2 ao exão 33 de TNXB encontrado em 3 doentes não consanguíneos com 21-OHD mas com a mesma origem geográfica, Cabo Verde. Este é o primeiro alelo descrito cujo presumível evento que originou a delecção não envolve dois genes parálogos no agrupamento RCCX.Congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency (21-OHD) is one the most common autosomal recessive disorders. 21-OHD impairs cortisol biosynthesis leading to increased adrenal androgens and external genitalia virilisation in female foetus. The 21-OH coding gene, CYP21A2, lies together with its pseudogene (CYP21A1P) in the RCCX cluster (6p21.3). The most common structure of this cluster comprises the following genes: Telomere-5’-RP1-C4A-CYP21A1P-TNXA-RP2-C4B-CYP21A2-TNXB-3’-Centromere. A complete and safe molecular characterization of the 21-OHD requires not only a strategy that enables the detection of sequence variations on the CYP21A2 gene but also methodologies that enable the detection of gene copy number variations and hybrid genes. For detection of these structural and numerical alterations involving the CYP21A2 gene and the CYP21A1P pseudogene, Southern-blotting was the most frequently used methodology in recent times. Although this methodology allows the detection of these alterations on RCCX cluster it is a laborious and time consuming technique which requires large amounts of DNA and implies the use of radioactivity. In addition this technique does not allow the characterization of the extension of conversions or chimeras. This work evaluates the use of MLPA (Multiplex ligation-dependent probe amplification), a recent technique for gene copy number assessment, in the study of the RCCX cluster recombined alleles, particularly those involving the CYP21A2 gene and CYP21A1P pseudogene, highlighting the possibilities and limitations of this technique specially concerning the molecular diagnostic purpose. In this context it were molecular characterized, by MLPA and other molecular techniques, a total of 200 alleles: 94 alleles with structural and/or numerical alterations involving the CYP21A2 and/or CYP21A1P (38 duplications, 17 deletions, 20 macroconversions, 19 chimeras), 43 bimodular alleles with point mutations on CYP21A2 gene and 63 normal alleles. Furthermore, this work reports an individual presenting a phenotype characteristic of 21-OHD, homozygous for a duplicated CYP21A2 allele with the 3’-centromeric copy mutated which may highlight the ongoing controversy about the functionality of CYP21A2 duplicated copies. Finally, we report a unique allele with a deletion extending from intron 9 of CYP21A2 to exon 33 of TNXB found in 3 non consanguineous 21-OHD patients with the same geographical origin, Cape Verde. This allele is the first to be reported resulting from an event not involving two paralog genes in the RCCX cluster

Restrição de crescimento fetal e cromossomopatias: 5 anos de resultados de DPN no INSA

As anomalias do crescimento fetal são uma importante causa de morbilidade e mortalidade perinatais. Os fatores envolvidos na restrição de crescimento fetal (RCF) podem ser maternos, placentários e fetais. Nos fatores fetais, as cromossomopatias estão descritas entre 6 e 32% dos fetos com RCF. Avaliar o tipo e significado das cromossomopatias, na etiologia da RCF, e do seu valor diagnóstico em pré-natal. Avaliar o impacto da introdução da metodologia de microarray no DPN por comparação com o cariotipo. Procedeu-se ao estudo retrospetivo das amostras recebidas, entre nov-2013 e nov-2018, com indicação clínica de RCF isolado ou associado a alterações ecográficas. O Diagnóstico Rápido de Aneuploidias (DRA) foi usado como teste inicial seguido por estudos por citogenética clássica ou por microarray. No período considerado recebemos 56 amostras com indicação de RCF, com idade gestacional entre as 11 e as 34 semanas. Em parte das amostras foi pedido DRA, estudo citogenético ou pesquisa de microdeleções e noutras foi pedido DRA e estudo por microarray. Foram identificadas 6 alterações cromossómicas em 31 casos com estudo citogenétco/pesquisa de microdeleções. Nos casos com microarray foram detetadas 5/25 alterações. Nos 11 (19,6% dos casos) fetos portadores de cromossomopatia, cinco apresentavam RCF isolado, ou associado a alterações do líquido amniótico, e os outros seis apresentavam RCF associada a outras malformações fetais, designadamente do foro cardíaco. As cromossomopatias identificadas nestes fetos incluíram trissomias 18, triploidias e ganhos/perdas de material genómico nos casos estudados por microarray. Nestes últimos, quatro alterações não seriam detetáveis por cariotipo, revelando o maior valor diagnóstico daquela metodologia. A triploidia é comum nos casos de RCF e constitui cerca de 27% das anomalias encontradas nesta coorte podendo, assim, a RCF ser considerada como bom marcador desta situação. Globalmente, a frequência de anomalias encontrada (cerca de 20%) revela a importância do diagnóstico genético em fetos com RCF.N/