Optimierung synthetischer Inhibitoren des Gerinnungsfaktors Xa vom 4-Amidinobenzylamid-Typ

Die Entwicklung von wirksamen und sicheren Antikoagulantien, die ergänzend und anstelle der bisherigen Standardtherapeutika zur Behandlung thromboembolischer Erkrankungen eingesetzt werden können, ist weltweit ein aktuelles Forschungsziel vieler Firmen und Gruppen. Dabei ist, neben Thrombin, auch der Gerinnungsfaktor Xa (FXa) ein wichtiges Zielenzym, das entscheidend an der Regulierung der Blutgerinnung beteiligt ist. In den letzten Jahren sind viele synthetische niedermolekulare FXa-Inhibitoren entwickelt worden und einige oral wirksame Verbindungen befinden sich zur Zeit in der klinischen Entwicklung. Bislang ist jedoch kein oral bioverfügbarer Hemmstoff des FXa als Arzneimittel zugelassen. Im Rahmen dieser Arbeit sollten die Grundstrukturen bereits bekannter Inhibitoren optimiert werden, um eine Verbesserung der Affinität, verbunden mit einer verzögerten Eliminierung aus der Zirkulation im Tiermodell an der Ratte zu erreichen. Idealerweise sollten die Verbindungen auch oral aufgenommen werden. Durch gezielte Substitution der P3-Aminosäure ist es gelungen, mehrere wirksame und selektive Substrat-analoge FXa-Hemmstoffe mit D-Homophenylalanin und anderen aromatischen Homoaminosäuren, wie z.B. D-Homotyrosin und verschiedenen D,L-Homopyridylalaninen, in P3-Position zu entwickeln. Dagegen konnte nur in wenigen Fällen ein verzögertes Eliminationsverhalten der Inhibitoren erreicht werden. Das Modeling der Verbindung 802 im Komplex mit FXa hat gezeigt, dass im Vergleich zu den D-Phenylalanin-Derivaten der aromatische Ring des P3-D-Homophenylalanins aufgrund der zusätzlichen Methylengruppe in der Seitenkette optimal in der Aryl-Bindungstasche lokalisiert ist. Die durchgeführten Variationen an P4- und P2-Resten in Kombination mit D-Homophenylalanin, D-Homotyrosin und verschiedenen D,L-Homopyridylalaninen haben zu Inhibitoren mit sehr unterschiedlichen Hemmkonstanten geführt. Eine Substitution des P4-Rings mit Carboxymethyl- oder Nitrogruppen sowie Pyridylringen bewirkte in den meisten Fällen einen Affinitätsverlust, lediglich der Einbau einer Aminogruppe in para-Position am P4-Ring führte zu einer leichten Verstärkung der FXa-Hemmwirkung. Allerdings wurden bei Untersuchung des P4-Amino-substituierten Inhibitors 760 im Ames-Test mutagene und zytotoxische Effekte beobachtet, die möglicherweise auf die anilinische Aminofunktion zurückzuführen sind. Deshalb wurde bei der weiteren Optimierung der Inhibitoren auf den Einbau des 4-Aminobenzylsulfonylrestes in P4-Position verzichtet. Daneben zeigte sich bezüglich Affinität und Selektivität eine deutliche Präferenz des FXa für Gly als P2-Rest; der Einbau anderer Aminosäuren führte zu weniger wirksamen Inhibitoren mit geringerer Selektivität. Um die schnelle Eliminierung der Hemmstoffe im Tierversuch zu reduzieren, wurde der Stickstoff der P4- und P3-Pyridylringe zu den entsprechenden N-Oxiden oxidiert. Diese Modifizierungen bewirkten am P4-Ring in allen Fällen einen starken Affinitätsverlust. Im Gegensatz dazu führte der Einbau des D,L-2-Homopyridylalanin-N-Oxids in P3-Position zu einem Inhibitor (1215) mit starker FXa-Hemmwirkung, exzellenter Selektivität und einer deutlich verzögerten Eliminationsgeschwindigkeit an der Ratte nach i.v.-Gabe. Da aus früheren Synthesen bekannt war, dass FXa in P3-Position Aminosäuren in der D-Konfiguration bevorzugt, wurde eine Racemattrennung der D,L-Homopyridylalanine durchgeführt. Gegenüber den racemischen Inhibitoren sind deren D-Derivate - wie erwartet - inhibitorisch etwa doppelt so aktiv. Der Hemmstoff 1332 mit D-2-Homopyridylalanin-N-Oxid ist mit einem Ki-Wert von 0,32 nM der wirksamste aller bis dahin untersuchten FXa-Inhibitoren dieses Strukturtyps. Obwohl die Verbindung 1332 im Vergleich zum racemischen Inhibitor 1215 schneller eliminiert wird, zeigt sich in allen anderen Untersuchungen eine erhöhte Wirksamkeit im Vergleich zum Racemat. Neben den verbesserten Ki-Werten ist der Hemmstoff 1332 auch in vitro im Gerinnungstest (aPTT und PT) etwa doppelt so aktiv; der ED50-Wert der antithrombotischen Wirksamkeit in vivo wurde ebenfalls deutlich verbessert. Aufgrund der positiv geladenen Benzamidingruppe in P1-Position besitzen die Hemmstoffe keine orale Bioverfügbarkeit. Um die orale Aufnahme des Inhibitors 1332 zu erhöhen, wurde dessen Hydroxyamidino-Prodrug 1331 synthetisiert. Während der Resorptionsversuche mit dem Prodrug 1331 an der Ratte traten ungewöhnlich starke Schwankungen in den für Inhibitor 1332 gemessenen Blutspiegeln auf. In einigen Fällen sind die erhaltenen Plasmaspiegel nach oraler bzw. duodenaler Applikation jedoch mit denen des Thrombinhemmstoffs Ximelagatran vergleichbar, der zu etwa 20 % oral bioverfügbar ist

Entwicklung, Synthese und Charakterisierung neuer Inhibitoren der West-Nil-Virus NS2B-NS3-Protease

Ersatz der P1-P3-Reste durch acylierte Diaminobutter- und Diaminopropansäure-Derivate. Aufbauend auf den Ergebnissen von Dr. Zhouhir Hammamy sollten neue substratanaloge Inhibitoren gegen die NS2B-NS3-Protease des WNV und des DEN2-Virus entwickelt und charakterisiert werden. Dabei sollten zuerst die P1-P3-Reste der Leitstruktur PhAc Lys Lys Arg NH2 (9) variiert werden. Da bereits sehr viele andere proteinogene und nichtproteinogene Aminosäuren in vorherigen Arbeiten ohne Erfolg in die substratanlogen Hemmstoffe eingebaut wurden, sollte eine neue Strategie zum Aufbau ungewöhnlicher Reste untersucht werden, die prinzipiell vielfältige Variationsmöglichkeiten bietet. Dabei wurde alpha-, gamma-Diaminobutter- und alpha-, beta-Diaminopropansäure in die Inhibitoren eingebaut, die nach Acylierung mit weiteren alpha-Aminosäuren Seitenketten aufweisen, die der Länge des Lysin ähneln. Durch die Kupplung der unterschiedlichen Aminosäuren an Dap oder Dab sollten auf bequeme Weise zahlreiche neue Verbindungen zugänglich sein. Die Reste Dap(Gly) und Dap(N(Ca)Gly) erwiesen sich mit einem Ki-Wert von rund 17 µM als die besten P1-Modifikationen, jedoch führt ihr Einbau im Vergleich zu Verbindungen mit P1-Arg zu deutlich schwächeren Hemmstoffen der WNV-Protease. In P2-Position wurde durch Einbau von Dap(Gly) ein Inhibitor mit einem Ki-Wert von ca. 12,2 µM erhalten, in P3-Position führten die Verbindungen mit Dap(Gly), Dap(Val) oder Dap(Ala) zu Derivaten mit Hemmkonstanten der WNV-Protease im Bereich um 30 µM. Im Vergleich zum Hemmstoff PhAc Lys Lys Arg NH2 (9) waren diese Verbindungen jedoch durchgehend deutlich weniger wirksam. Im Vergleich zur Ausgangsverbindung 9 waren alle neuen Derivate dieser Serie ebenfalls deutlich schwächere Hemmstoffe der DENV-2-Protease. Daher hat sich diese Strategie, Lysin durch mit alpha-Aminosäuren acylierte Dap- oder Dab-Reste zu ersetzen, als ungeeignet erwiesen.   Ketonderivate als Inhibitoren der NS2B-NS3-Proteasen Im Gegensatz zu den irreversibel hemmenden Chlormethylketon-Inhibitoren sind zahlreiche andere peptidische Ketonderivate übergangszustandsanaloge Inhibitoren (transition-state-inhibitors) von Serinproteasen, die diese durch einen reversibel-kovalenten Bindungsmodus hemmen. In dieser Arbeit wurden zwei Arginyl-Ketone aus dem entsprechenden Weinrebamid dargestellt. Das Weinrebamid wurde ausgehend von Boc-Arg(Mtr)-OH, das mit N-Methyl-O-Methylhydroxylamin umgesetzt wurde, hergestellt. Das letztendlich erhaltene peptidische Ethylketonderivat (Verbindung 24) stellte sich mit einem Ki-Wert von 1,07 µM als wirksamer WNV Hemmstoff heraus. Das sterisch anspruchsvollere Benzylketonanalogon (Verbindung 26) war um den Faktor 24 schwächer wirksam, das Methylketonderivat konnte nicht dargestellt werden. Bei der DENV-2-Protease war das Benzylketon mit einer Hemmung von 19,1 % die wirksamste Verbindung. Diese Hemmung entspricht einem Ki-Wert von ca. 130 µM. Zellpenetrierende zyklische Peptidinhibitoren Um die NS2B-NS3-Protease zu adressieren, müssen die Inhibitoren ins Zytosol und damit durch die Zellmembran gelangen. Eine prinzipielle Möglichkeit diesen Schritt zu ermöglichen, ist eine kovalente Verknüpfung der Hemmstoffe mit zellpenetrierenden, zyklischen Peptidderivaten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei zyklische, zellpenetrierende Inhibitoren (Verbindung 27, 28) hergestellt. Die wirksamere Verbindung 27, enthält eine CCP-Sequenz und ein Inhibitorsegment aus fünf DArg-Resten. Die Sequenz des CCP ist an die Arbeit von Pei et al. angelehnt.111 Der Ki-Wert zur Hemmung der WNV-Protease ist 0,5 µM und für die DENV-2-Protease 2,9 µM. Jedoch wurden von diesen beiden Verbindungen nur sehr geringe Mengen erhalten (siehe 3.5). Um deren Testung in Zellkultur durchzuführen, müssten die Synthesen wiederholt werden. Es ist jedoch nach Testung strukturell ähnlicher zyklischer Furininhibitoren aus unserem Arbeitskreis bekannt, dass solche relativ großen Peptidstrukturen nur eine schwache antivirale Wirksamkeit gegen WNV und DENV-2 in Zellkultur besitzen (Testung im Arbeitkreis Bartenschlager, Univ. Heidelberg).   Cholesteryl- und Dihydrocholesterylderivate Durch die Kupplung des sehr lipophilen Cholesterylrestes an die Inhibitorleitstruktur 4-AMe-PhAc-Lys-Lys-Arg-NH2 sollte die Zellpermeabilität der Verbindung verbessert werden. Während der Synthese der beiden Cholesterylderivate 29 und 30 fiel auf, dass es aufgrund einer Nebenreaktion zu einer Sättigung der Doppelbindung an Position 5 im Cholesterylsegment kam. Deswegen wurde diese anschließend bewusst hydriert und die Inhibitoren 31 - 34 dargestellt. Die Verbindungen 31 – 33, die sich nur durch die unterschiedliche Anzahl der Ethylenglykollinker-Bausteine (EGL) unterscheiden, waren mit einem IC50 von ca. 0,6 - 0,7 µM alle ähnlich wirksame Hemmstoffe der WNV-Protease. Überraschend war, das zum Vergleich hergestellte Cholesterylderivate ohne vollständiges P1-P4-Segment zwar etwas weniger wirksam waren, aber die WNV-Protease in der gleichen Größenordnung hemmen (Unterschied im IC50-Wert < Faktor 10). Dies deutet eher auf eine unspezifische Hemmung durch den Cholesterylteil dieser Derivate hin. Die Testung dieser Verbindungen in Zellkultur zeigte, dass diese Cholesteryl- bzw. Dihydrocholesterylderivate relativ zelltoxisch sind, bei einer Konzentration von 12,5 µM der meisten Verbindungen überlebten nur weniger als 60 % der Zellen. Daher konnten diese Verbindungen maximal bei einer Konzentration von 5 µM getestet werden. Die Reduktion der Virusvermehrung war im Vergleich zu den Referenzverbindungen MI-1230 (4-Gua-Me-PhAc-Arg-Lys-Arg-Amba) und Ribavirin schwächer ausgeprägt. Die Ergebnisse zeigten, dass die kovalente Kupplung von Cholesterylderivaten an die peptidischen Proteasehemmstoffe zumindest für diese Anwendung ungeeignet ist. Inhibitoren mit zusätzlichem P5-Rest Durch die Anknüpfung eines zusätzlichen P5-Restes an den mit einer p-Aminomethylgruppe substituierten P4 PhAc-Rest der Leitstruktur 9 sollte die Affinität der Verbindungen erhöht werden. Die Hemmwirkungen dieser Inhibitoren 35 – 39 waren mit Ki-Werten zwischen 1,8 bis 2,6 µM sehr ähnlich. Auch der Ki-Wert der Leitstruktur liegt in dieser Größenordnung. Durch Modellierung des Bindungsmodus konnte dieser Sachverhalt vermutlich erklärt werden. Der zusätzliche P5-Rest kommt nicht in direkten Kontakt mit der Protease und ragt ins Lösungsmittel (Abbildung 22). Daher hat er kaum Einfluss auf die Affinität der Verbindungen. Weitere P5-Modifizierungen in para-Position des P4-Restes sind wahrscheinlich wenig sinnvoll. Eventuell könnte man zukünftig noch die Ankupplung des P5-Restes an die meta- oder ortho-Position der P4-PhAc-Gruppe untersuchen. Dockingstudien zur Erlangung neuer Inhibitorstrukturen Mit Hilfe der Arbeitsgruppe Kolb wurden Dockingexperimente mit der WNV-Protease (PDB: 2YOL) durchgeführt. Es wurden vier potenzielle Inhibitorfragmente identifiziert und deren prozentuale Hemmwirkung auf die WNV-Protease bei einer Konzentration von 625 µM bestimmt. Zwei Fragmente zeigten mit 17 % und 12 % eine gewisse Hemmwirkung. Aus diesen Fragmenten wurden fünf Inhibitoren (47 - 51) synthetisiert. Die Hemmwirkungen dieser Verbindungen waren jedoch nur sehr schwach. Das Derivat 48 ist mit einem Ki-Wert von 60,4 µM die wirksamste Verbindung dieser Serie. Die Tatsache, dass die Einzelfragmente eine gewisse Hemmung zeigten, die dargestellten Inhibitoren jedoch wenig wirksam waren, lässt darauf schließen, dass die Verknüpfung der Fragmente verbessert werden muss. Hemmung der WNV-Protease durch Zinkionen Durch enzymkinetische Messungen mit der WNV-Protease wurde für Zinkionen ein Ki-Wert von ca. 31 µM ermittelt. Dabei konnte gezeigt werden, dass das korrespondierende Anion der eingesetzten Zinksalze keinen Einfluss hat, sowohl Zinkchlorid, Zinknitrat als auch Zinkacetat zeigten die gleichen Hemmwirkungen. Durch andere Metall-Kationen wurde keine oder nur eine sehr geringe Hemmung der WNV-Protease festgestellt. Für die DENV-2 NS2B-NS3-Protease konnte keine signifikante Inhibierung durch Zink- oder andere Metallkationen festgestellt werden. Mit dem Komplexbildner EDTA, der Zinkionen komplexiert, konnte die Hemmung der WNV-Protease nahezu vollständig aufgehoben werden, demzufolge kommt die Hemmung eindeutig durch die Zinkionen zustande (siehe 3.13.1). Die Hemmung der WNV-Protease durch Zinkionen wurde weiter enzymkinetisch untersucht. Die Lage des Schnittpunktes in Lineweaver-Burk-Auftragungen weist auf einen nichtkompetitiven Hemmmechanismus durch die Zinkionen hin. Mittels eines Webserverdienstes wurde nach möglichen Bindungsorten für Zink gesucht. Eine vorhergesagte Bindungsstelle bestand aus drei Aminosäuren in der Nähe des aktiven Zentrums, die das Ser135 der katalytischen Triade einschließt. Da trotz Bindung des Zinkions an diese vorhergesagte Bindungsstelle noch Platz innerhalb der Bindungstasche für einen weiteren Inhibitor besteht, wurde in weiteren Versuchen untersucht, wie sich die Hemmwirkung von bekannten Inhibitoren in Gegenwart von Zinkionen verhält. Es wurde gezeigt, dass der IC50-Wert des Inhibitors 24 (PhAc-Lys-Lys-Arg-Ethylketon) durch Zusatz von Zinkionen erniedrigt wird. Die Prüfung des Zinkchlorids in Zellkultur zeigte jedoch bei den eingesetzten Konzentrationen von 25 µM bis 20 µM keine signifikante Reduktion der WNV-Vermehrung. Möglicherweise werden nur unzureichende Konzentrationen der Zinkionen aufgenommen

Klonierung, Expression und enzymkinetische Charakterisierung der hämagglutininspaltenden Protease TMPRSS2

TMPRSS2 ist eine Typ II transmembrane Serinprotease mit einer multidomänen Struktur, die das Oberflächenglykoprotein Hämagglutinin (HA) der Influenzaviren mit einer monobasischen Schnittstelle spaltet. Dies ist eine Voraussetzung für die Virusfusion und Vermehrung. Weiterhin aktiviert sie das Fusionsprotein F des humanen Metapneumovirus sowie das Spike S Protein der SARS Coronaviren. Zudem wurde eine TMPRSS2-Expression in einigen Tumorgeweben beschrieben. Daher scheint, TMPRSS2 eine potentielle Zielstruktur in der Wirkstoffforschung zu sein. Die katalytische Domäne der TMPRSS2 wurde in E.Coli exprimiert und für Inhibitionsstudien mit zuvor synthetisierten Inhibitoren einiger trypsinartiger Serinproteasen verwendet. Es wurden zwei Inhibitortypen identifiziert, die TMPRSS2 im nanomolaren Bereich hemmen. Die erste Serie umfasst substratanaloge Inhibitoren mit einem 4-Amidinobenzylamid-Rest in P1 Position, wobei einige Verbindungen Hemmkonstanten um 20 nM besitzen. Eine gesteigerte Hemmung konnte für den zweiten Inhibitortyp mit einem sulfonylierten 3-Amindinophenylalanylamid gefunden werden. Die beste Verbindung dieser Serie hemmt TMPRSS2 mit einem Ki-Wert von 0,9 nM und zeigt eine effektive Hemmung der Influenzavirus-Ausbreitung in humanen bronchialen Epithelzellen. Basierend auf diesen Inhibitorstudien wurden neue fluorogene Substrate mit einem D-Arginin in P3-Position synthetisiert. Einige dieser Substrate werden effektiv durch TMPRSS2 gespalten

Synthese und Charakterisierung von Inhibitoren der hämagglutininspaltenden Proteasen Furin und HAT

In der vorliegenden Arbeit wurden Inhibitoren der hämagglutininspaltenden Proteasen Furin und HAT synthetisiert und charakterisiert. Während die Proproteinkonvertase Furin das Hämagglutinin (HA) hochpathogener Influenzaviren vom Subtyp H5 und H7 aktiviert, bewirkt die trypsinartige Serinprotease HAT die Spaltung des HA saisonaler Influenzaviren der Subtypen H1, H2 und H3. Die entwickelten Hemmstoffe dieser Proteasen können somit als Ausgangsstoffe für die Entwicklung neuer antiviraler Wirkstoffe zur Therapie der Influenza dienen. Ein Bis-Amidinohydrazonderivat wurde in einem screening als Startpunkt für die Entwicklung neuer niedermolekularer Furininhibitoren identifiziert. In vier Syntheseserien wurden Furininhibitoren dieses Typs dargestellt. In der ersten Serie wurden kommerziell erhältliche Carbonylverbindungen als Ausgangsmaterial verwendet. Die wirksamste Verbindung dieser Serie mit einem Ki-Wert von 1,5 µM ist der vom Terephthalaldehyd abgeleitete Inhibitor. In zwei weiteren Serien wurden Derivate mit drei oder vier basischen Funktionen synthetisiert. Die Kopplung von 4 Guanidinobuttersäure an die Leitstruktur MI-0007 in der zweiten Serie und die Darstellung tetrabasischer Verbindungen unter Verwendung von in der dritten Serie führten zu Inhibitoren mit Hemmkonstanten von 0,5 - 0,6 µM. Ein aus der Literatur bekanntes, vom Salicylaldehydbenzylether abgeleitetes, monovalentes Amidinohydrazon mit einem Ki-Wert von 11,8 µM wurde als Leitstruktur einer vierten Serie von Furininhibitoren genutzt. Jedoch waren die Verbindungen dieser Serie weniger wirksam als die entsprechende aus der Literatur bekannte Ausgangsverbindung. Mit Ausnahme einer Verbindung, weisen alle im Rahmen dieser Arbeit synthetisierten Amidinohydrazonderivate eine hohe Selektivität gegenüber den untersuchten trypsinartigen Serinproteasen Thrombin, Faktor Xa und Plasmin auf (Ki-Werte > 30 µM). Für die trypsinartige Serinprotease HAT wurden bisher nur wenige Inhibitoren in der Literatur beschrieben. Deshalb begannen die Arbeiten zur Entwicklung der HAT-Inhibitoren mit einer Testung von im Arbeitskreis verfügbaren Verbindungen. Neben substratanalogen Inhibitoren mit einem C terminalen 4-Amidinobenzylamid konnten Verbindungen mit einem zentralen 3-Amidinophenylalanin des 3-TAPAP-Typs als Startpunkte für die Entwicklung von HAT-Hemmstoffen identifiziert werden. In sämtliche substratanaloge Inhibitoren wurde in P4- ein Benzylsulfonylrest und in P1-Position ein 4-Amidinobenzylamid eingebaut. In einer ersten Serie mit einem Prolin als P2-Rest wurden in P3 Position verschiedene D-Aminosäurereste akzeptiert, besonders jedoch das basische D-Arginin oder D-homo-Arginin. Akzeptiert werden auch hydrophobe Aminosäurederivate, wie ein tert.-butyl-geschütztes D-Asp oder D-Glu (Ki < 40 nM). Aufgrund der Präferenz für basische und hydrophobe Aminosäurereste in P3-Position, wurden in einer zweiten Serie die Seitenketten von D-Asp und D-Glu mit verschiedenen zyklischen Aminen modifiziert. Die wirksamste Verbindung wurde durch Kopplung von 1-(2-Pyrimidyl)piperazin an die Seitenkette von D-Glu erhalten und hemmt HAT mit einem Ki-Wert von 17 nM. Da substratanaloge Inhibitoren mit einem P2-Prolin häufig auch andere trypsinartige Serinproteasen hemmen, wurde der Einfluss anderer Aminosäuren in P2-Position in Kombination mit D-Arginin als P3-Rest untersucht. Die stärkste Hemmwirkung innerhalb dieser Serie mit Ki Werten < 30 nM wurde für kleine hydrophobe Aminosäurereste, wie 2-Aminobuttersäure (Abu), Norvalin (Nva), Valin oder Alanin gefunden. Ein Vorteil der Derivate mit Abu oder Nva in P2-Position ist deren verbesserte Selektivität gegenüber den Proteasen Thrombin, Faktor Xa und Plasmin. Die Verbindung Bzls-D-Arg-Nva-4-Amidinobenzylamid ist mit einer Hemmkonstante von 15 nM der erste Inhibitor, der die anderen getesteten Proteasen schwächer hemmt und somit die höchste Selektivität für HAT aufweist. Ausgewählte substratanaloge Inhibitoren wurden in Zellkulturversuchen eingesetzt, um die Hemmung der Vermehrung von Influenzaviren zu untersuchen. Eine besonders starke Hemmwirkung auf Influenzaviren der Subtypen H1 und H3 wurde durch Inhibitoren mit Norvalin oder 2-Aminobuttersäure in P2-Position bestimmt. Die Inhibitoren weisen darüber hinaus keine signifikante Zytotoxizität auf, so dass die reduzierte Virusausbreitung auf die HAT-Hemmung zurückzuführen ist. In der vorliegenden Arbeit wurden zahlreiche substratanaloge Inhibitoren identifiziert, die HAT mit Ki-Werten < 30 nM hemmen. Im Gegensatz zu den bereits etablierten antiviralen Wirkstoffen hemmen alle im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Furin- und HAT-Inhibitoren Zielstrukturen des Wirts. Deshalb sollten auch bei längerer Verwendung dieser Verbindungen keine Resistenzen auftreten

Development of new inhibitors for the type II transmembrane serine protease matriptase

Several new inhibitors were prepared and tested as potential matriptase inhibitors. The most potent compounds were found among the tertiary amides of arylsulfonylated-3-amidinophenylalanines. The incorporation of suitable bis-substituted biphenylsulfonyl groups in combination with appropriate C-terminal urea structures provided the final strong potent monobasic matriptase inhibitors with acceptable selectivity against related trypsin-like serine proteases. Such compounds are suitable candidates for their further evaluation in cell culture experiments to elucidate the potential role of matriptase in pathophysiological processe

Synthese neuartiger Thrombinhemmstoffe zur Entwicklung gerinnungshemmender Liposomen

Im Rahmen dieser Dissertation ist es gelungen ist, hochwirksame Thrombininhibitoren mit Palmitinsäure-, Biotin- und bifunktionellen Ethylenglykol-Resten zu modifizieren, wobei die Hemmwirkung nahezu erhalten blieb. Die freien biotinylierten Inhibitoren eignen sich zur Untersuchung von Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen, beispielsweise mittels SPR-Messungen. Die palmitoylierten Inhibitoren wurden in die DPPC/CH-Liposomen eingebaut. Ein damit verbundenes Ziel war eine Molekulargewichtsvergrößerung der Wirkstoffe, die zu einer deutlichen Einschränkung der renalen Filtration führen sollte. Obwohl die Wirkung dieser Konjugate in vivo noch nicht gezeigt werden konnte, ist anzunehmen, dass der Konjug-ationsprozess eine verlängerte Verweildauer der Inhibitoren in der Zirkulation zur Folge haben dürfte. Die in dieser Arbeit beschriebenen Methoden, insbesondere die Multimerisierung, lassen sich auch auf andere Wirkstoffe übertragen. Voraussetzung dafür ist allerdings, dass sich die betreffenden Wirkstoffe ohne Aktivitätsverluste über einen geeignenten flexiblen Spacer mit Fettsäureresten modifizieren lassen. Durch die infolge der Multimerisierung erzielte Vergrößerung des Molekulargewichtes der Wirkstoffe lässt sich die jeweilige renale Eliminierungsgeschwindigkeit wesentlich reduzieren. Folglich müssen diese Wirkstoffe weniger häufig verabreicht werden, um den erforderlichen Wirkstoffspiegel am Wirkort zu gewährleisten. Hierdurch ergeben sich in der Praxis relevante Vorteile wie geringere Toxizität sowie effizientere Kosten-Nutzen-Relationen

Characterization of the Hemagglutinin Cleaving Transmembrane Serine Proteases Matriptase and TMPRSS2

Influenza is one of the commonest infectious diseases affecting millions of people every year including 290,000 – 650,000 heavy casualties. Influenza viruses undergo constant genetic changes and every 10 – 50 years new influenza virus strains emerge that potentially cause a severe pandemic. In this modern interconnected world, experts believe the next influenza pandemic will be a “devastating global health event with far-reaching consequences” [1]. Novel effective anti-influenza drugs are in need. One strategy of influenza research is to focus on host-specific proteases that are essential for virus activation and spread. Trypsin-like serine proteases are crucial for influenza activation by mediating the cleavage of the viral surface glycoprotein HA and hence promoting the fusion potential of the virus. Therefore, their inhibition provides a promising therapeutic approach. The present work focused on the characterization of two relevant HA cleaving type-II transmembrane serine proteases matriptase and TMPRSS2. Chapter 3 and chapter 4 of this thesis engaged with the recombinant production of matriptase (chapter 3) in order to obtain a pure functional enzyme of high quality for a SAR study with novel monobasic (hence potentially bioavailable) matriptase inhibitors of the 3-amidinophenylalanine type (chapter 4). Adequate amounts of high-quality matriptase enzymes were isolated using a new expression system and in total 5 matriptase crystals were available at the end of this thesis for structural analysis. The matriptase inhibitor design in this thesis focused on matriptase-affine compounds with a fair selectivity profile against the blood coagulation enzymes thrombin and fXa. In total, 18 new monobasic and potentially bioavailable, as well as four new dibasic compounds of the 3-amidinophenylalanine types were tested. Based on the last published crystal structure of this inhibitor type in complex with matriptase from 2006 (PDB code 2GV6) docking was used as a structure-based virtual screening method for lead optimization of the compounds N-terminus. Selected compounds were suggested to interact with the carbonyl side chain of Gln175 of matriptase to achieve a higher affinity of matriptase compared to fXa. The 4-tert-butylureido-piperidine could be identified as suitable C-terminus in combination with 3-fluoro-4-hydroxymethyl biphenylsulphonyl N-terminally in order to obtain excellent selectivity over thrombin. The binding mode of this compound (compound 55) was crystallographically determined in complex with matriptase as well as trypsin. Trypsin proved as a suitable alternative to matriptase for detailed binding mode analysis of the compounds N-terminus. However, different preferences were detected for the C-terminus. Dibasic compounds showed higher matriptase affinity and selectivity in comparison with the monobasic analogues. However, the tested monobasic compounds were still decent matriptase inhibitors that are additionally suitable for cell culture and animal studies in their benzamidine prodrug forms, which are well established from related inhibitors of thrombin. In addition, selected monobasic as well as dibasic compounds demonstrated strong suppression of the replication of certain H9N2 influenza viruses in a matriptase-expressing MDCK II cell model. These matriptase inhibitors could be potential lead structures for the development of new drugs against H9 strains for influenza. TMPRSS2 is widely discussed for its role in influenza activation. With a TMPRSS2 dependancy of HA-activation of certain subtypes, the characterization of this protease is an important prerequisite for being available as a target for influenza drug design. However, only little is known about the physiological function of TMPRSS2 and no experimental structure data are available at the moment to enable a structure-based drug development. Therefore, chapter 5 of this thesis focused on the characterization of TMPRSS2 in order to develop a strategy for the isolation of proteolytically active TMPRSS2 from cell culture. Even though, no functional TMPRSS2 could be recovered at the end of this work some new structural characteristics of TMPRSS2 were identified as crucial for functionality insight the cell. In general, TMPRSS2 without the cytosolic part, the transmembrane domain and the LDLRA domain is able to undergo autocatalytically activation if an artificial signal peptide was added N-terminal to enable entry into the endoplasmic reticulum. The presence of the cysteine-rich SRCR domain and the presence of the disulfide chain that connects the SPD and the stem region after activation cleavage have been identified as crucial for activity. N-terminal truncation of TMPRSS2 did not result in obvious dislocation within the cell: as the full-length positive control truncated TMPRSS2 was exclusively found in cell compartments surrounding the nucleus in immunofluorescence experiments. However, a reduced proteolytic cleavage activity towards H3-HA in co-expression experiments has been observed and might be a result of dislocation, since truncated TMPRSS2 is not bound to the biomembrane anymore. In addition, TMPRSS2 has been identified as a potential substrate of matriptase in vitro, which suggests possible participation in several zymogen cascades

Synthese, Charakterisierung und Anwendung neuer Inhibitoren der Proproteinkonvertase Furin

Die Typ-I Transmembranprotease Furin gehört zur Familie der Proproteinconvertasen und ist ubiquitär im menschlichen Körper verbreitet. Furin aktiviert verschiedenste Proproteine, die sowohl in normalen physiologischen aber auch in zahlreichen pathophysiologischen Prozessen involviert sind. Beispielsweise aktiviert Furin Wachstumsfaktoren, deren Rezeptoren aber auch Matrixmetalloproteasen, die beim Tumorwachstum und der Metastasierung beteiligt sind. Zusätzlich prozessiert Furin verschiedene virale Glykoproteine und bakterielle Toxine. Diese Spaltung ist essentiell für die Vermehrung zahlreicher Viren oder der toxischen Wirkung humanpathogener Bakterien. Daher ist Furin ein potentielles Target der Wirkstoffentwicklung

Entwicklung, Synthese und Charakterisierung neuartiger Furininhibitoren

In der vorliegenden Arbeit wurden neuartige, effektive, peptidomimetische Inhibitoren der Proproteinkonvertase Furin synthetisiert und charakterisiert. Ausgehend von der Struktur des irreversiblen Referenzinhibitors Decanoyl-RVKR-chlormethylketon wurden Verbindungen entwickelt, in die anstelle des P1 Arg-chlormethylketon-Segmentes decarboxylierte Arginin- und Lysinmimetika sowie weitere zyklische basische Reste eingebaut wurden. Der Decanoyl-Rest wurde zunächst durch einen Phenylacetyl- oder Acetylrest sowie das Lysin in der P2-Position durch Arginin ersetzt. Die auf die Synthese folgende Bestimmung der Inhibitorkonstanten ergab, dass als wirksamster Inhibitor Phenylacetyl-RVR-4-(amidino)benzylamid (17) Furin mit einem Ki-Wert von 0,81 nM hemmt. Basierend auf dieser Leitstruktur wurden zur weiteren Optimierung verschiedene Inhibitorserien synthetisiert, bei denen nacheinander in allen Positionen der Struktur (P2-P5) verschiedene natürliche und unnatürliche Aminosäurereste oder Aminosäurederivate eingebaut wurden. So konnte gezeigt werden, dass der Austausch des P4-Arginins durch ein Lysin oder die Eliminierung der basischen Gruppe in der P2-Position zu einer drastischen Reduktion der inhibitorischen Effektivität führt. Der systematische Einbau aller proteinogenen Aminosäuren in die P3-Position zeigte, dass fast alle Derivate dieser Serie Furin effektiv hemmen, dabei waren neben Valin auch Isoleucin, Phenylalanin oder Tyrosin besonders geeignet. Der Einbau saurer Aminosäuren an dieser Stelle führte jedoch zu weniger wirksamen Inhibitoren, wahrscheinlich bedingt durch elektrostatische Abstoßung aufgrund des stark negativ geladenen, aktiven Zentrums des Furins. In der P5-Position wurden verschiedene Fettsäurereste eingebaut. Die Bestimmung der Inhibitorkonstanten ergab, dass sie bis zu einer Länge von 10 Kohlenstoffatomen annähernd im Bereich der Leitstruktur (17) liegt. Die weitere Verlängerung der Kohlenstoffkette führte allerdings zu einem sukzessiven Abfall der inhibitorischen Wirkung. Die Synthese von Inhibitoren mit basischen P5-Resten führte zu sehr potenten Wirkstoffen, von denen sich 3-(Guanidinomethyl)phenylacetyl-RVR-4-(amidino)benzylamid (38) mit einem Ki-Wert von 5,6 pM als der effektivste Inhibitor für Furin herausstellte. Untersuchungen zur Stabilität einiger Verbindungen mittels HPLC zeigten, dass unter den gewählten Bedingungen kein nennenswerter Zerfall oder Abbau nachzuweisen war. Als Beispiel dient Inhibitor 17, der in wässriger Lösung über 10 Tage bei Raumtemperatur stabil ist. In Zusammenarbeit mit der AG Garten (Institut für Virologie der Universität Marburg) wurden ausgesuchte Inhibitoren auf ihre Zytotoxizität in Zellkultur untersucht. Die wenig zytotoxisch wirkenden Verbindungen wurden anschließend in virologischen Untersuchungen zur Hemmung der Vermehrung und Ausbreitung hochpathogener Viren der klassischen Geflügelpest (H7N1) eingesetzt. Dabei wurde nachgewiesen, dass unter anderen die Inhibitoren 17 und 4-(Guanidinomethyl)phenylacetyl-RVR-4-(amidino)benzylamid (40) die Virusvermehrung effektiv hemmen. Die quantitative Bestimmung infektiöser Viren in Zellkulturen über einen Zeitraum von mehreren Tagen zeigte, dass die Zugabe des Inhibitors 40 zu einer signifikanten Verlangsamung der Virusausbreitung führt. So betrug der Virustiter nach 45 h nur 1,7 % der Kontrollkultur ohne Inhibitor. Zur Optimierung der Reinigung von rekombinant hergestelltem Furin für Kristallisationsexperimente wurden basierend auf der Leitstruktur N-terminal biotinylierte Inhibitoren für die Affinitätschromatographie synthetisiert. Diese Verbindungen wurden in Zusammenarbeit mit der AG Than (Institut für Altersforschung, Fritz Lipmann-Institut, Jena) für die Reinigung von Maus-Furin eingesetzt, indem kommerziell erhältliche Streptavidinsäulen mit den biotinylierten Inhibitoren beladen wurden. Mit diesen Affinitätssäulen gelang eine effektive Reinigung des Furins im Vergleich zu den bisher verwendeten, klassischen Reinigungsmethoden. Die im Rahmen dieser Arbeit synthetisierten, niedermolekularen Verbindungen sind die wirksamsten, reversibel bindenden Furinhemmstoffe, die bisher weltweit entwickelt wurden. Sie sind daher für weiterführende Untersuchungen in Zellkulturen oder gegebenenfalls sogar in Tiermodellen geeignet

Development and characterization of new peptidomimetic inhibitors of the West Nile virus NS2B-NS3 protease

Potent inhibitors of the West Nile virus NS2B-NS3 protease could be useful drugs for the treatment of WNV infections. Therefore, in the present work, new substrate analogue inhibitors against the WNV protease have been developed. In this present work, new decarboxylated arginine memtics inhibitors against the WNV NS2B-NS3 protease were developed. In comparison to the known agmatine derivatives, the P1 trans-4-Guanidinocyclohexylmethylamid containing inhibitors have higher potency and selectivity against the WNV. Moreover, the first crystal structure of the WNV protease in complex with small noncovalently-binding inhibitor was solved