Antifungal activity of actinobacteria against fungus isolates of clinical importance

The escalating use of antifungal agents and long-term treatment approaches has led to an increased prevalence of fungus species that are resistant to the most common antifungal drugs. Actinobacteria produce a wide variety of bioactive secondary metabolites. This study investigated actinomycete isolates with the potential to produce bioactive compounds against dermatophyte fungus species and Candida spp. of clinical importance. Antifungal activity of actinomycetes was assessed using the double-layer agar technique. Active isolates were cultivated in starch casein broth (SCB) at 30 ºC for 8 days. Aliquots were retrieved at 24-h intervals and centrifuged to obtain extracts. Extract activity was assessed using the well-diffusion method. No dermatophyte fungus isolate was inhibited in the double-layer assay, although isolates 1S, R18(6) and 6(2) were active against all Candida spp. used in the assay. The well-diffusion method revealed that isolate R18(6) inhibited the six Candida spp. in a 72-h growth period in SCB broth, showing good potential to yield a compound with antifungal activity.(Atividade antifúngica de actinobactérias contra fungos isolados de importância clínica).O uso crescente de antifúngicos e os tratamentos prolongados vêm aumentando a incidência de fungos resistentes às drogas antifúngicas comumente utilizadas. As actinobactérias são conhecidas por produzirem uma grande variedade de metabólitos secundários bioativos e este trabalho teve como objetivo selecionar isolados de actinomicetos com potencial para produção de compostos bioativos contra fungos dermatófitos e espécies de Candida de importância clínica. A atividade antifúngica dos actinomicetos foi avaliada pela técnica da dupla camada. Os isolados que apresentaram atividade foram cultivados em caldo amido caseína (AC) à temperatura de 30 ºC por oito dias e foram retiradas e centrifugadas alíquotas a cada 24h, para obtenção do extrato. A atividade dos extratos foi avaliada através da técnica de difusão em poço. Nenhum dos isolados de fungos dermatófitos foi inibido no ensaio de dupla camada e os isolados 1S, R18(6) e 6(2) mostraram atividade frente todas as espécies de Candida testadas. No ensaio de difusão em poço com os extratos, o isolado R18(6) inibiu as seis espécies de Candida em 72h de crescimento em caldo AC e mostrou grande potencial para obtenção de composto com atividade antifúngica

Effects of electroacupuncture on stress and anxiety-related responses in rats

The aim of this work was to investigate if eletroacupuncture at PC6 would modulate the stress-induced anxiety-like behavior and the level of activation of several brain areas. Rats were distributed in groups: control; submitted to immobilization; submitted to immobilization and eletroacupuncture at PC6 or at the tail. Immobilization increased grooming and decreased stretched attend postures and the time spent in the open arms of the ele-vated plus-maze. Eletroacupuncture at PC6 or tail canceled the effect of immobilization on grooming and attenuated the stretched attend posture. Immobilization increased Fos-immunoreactivity in the prefrontal cortex, medial and central amygdala, paraventricular and dorsomedial nuclei of the hypothalamus, lateral hypothalamus, dentate gyrus, CA1, CA2 and CA3 hippocampal areas. The activation of paraventricular, dorsomedial nuclei and prefrontal cortex by immobilization was canceled by electroacupuncture at PC6 and attenuated by electroacupuncture in the tail. The activation of the other areas was canceled by electroacupuncture in PC6 or the tail. It is concluded that immobilization induced anxiety-like behavior that was moderately attenuated by eletroacupuncture with difference between the stimulation in PC6 or the rat tail. Eletroacupuncture showed specificity concerning to the attenuation of the effects of immobilization in the CNS areas related to the stress response, anxiety and cardiovascular system.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)Univ Fed Sao Paulo, Dept Biociencias, Inst Saude & Soc, Campus Baixada Santista,Rua Silva Jardim 136, BR-11015020 Santos, SP, BrazilUniv Fed Sao Paulo, Dept Biociencias, Inst Saude & Soc, Campus Baixada Santista,Rua Silva Jardim 136, BR-11015020 Santos, SP, BrazilWeb of Scienc

Antifungal activity of actinobacteria against fungus isolates of clinical importance

(Antifungal activity of actinobacteria against fungus isolates of clinical importance). The escalating use of antifungal agents and long-term treatment approaches has led to an increased prevalence of fungus species that are resistant to the most common antifungal drugs. Actinobacteria produce a wide variety of bioactive secondary metabolites. This study investigated actinomycete isolates with the potential to produce bioactive compounds against dermatophyte fungus species and Candida spp. of clinical importance. Antifungal activity of actinomycetes was assessed using the double-layer agar technique. Active isolates were cultivated in starch casein broth (SCB) at 30 ºC for 8 days. Aliquots were retrieved at 24-h intervals and centrifuged to obtain extracts. Extract activity was assessed using the well-diffusion method. No dermatophyte fungus isolate was inhibited in the double-layer assay, although isolates 1S, R18(6) and 6(2) were active against all Candida spp. used in the assay. The well-diffusion method revealed that isolate R18(6) inhibited the six Candida spp. in a 72-h growth period in SCB broth, showing good potential to yield a compound with antifungal activity.(Atividade antifúngica de actinobactérias contra fungos isolados de importância clínica).O uso crescente de antifúngicos e os tratamentos prolongados vêm aumentando a incidência de fungos resistentes às drogas antifúngicas comumente utilizadas. As actinobactérias são conhecidas por produzirem uma grande variedade de metabólitos secundários bioativos e este trabalho teve como objetivo selecionar isolados de actinomicetos com potencial para produção de compostos bioativos contra fungos dermatófitos e espécies de Candida de importância clínica. A atividade antifúngica dos actinomicetos foi avaliada pela técnica da dupla camada. Os isolados que apresentaram atividade foram cultivados em caldo amido caseína (AC) à temperatura de 30 ºC por oito dias e foram retiradas e centrifugadas alíquotas a cada 24h, para obtenção do extrato. A atividade dos extratos foi avaliada através da técnica de difusão em poço. Nenhum dos isolados de fungos dermatófitos foi inibido no ensaio de dupla camada e os isolados 1S, R18(6) e 6(2) mostraram atividade frente todas as espécies de Candida testadas. No ensaio de difusão em poço com os extratos, o isolado R18(6) inibiu as seis espécies de Candida em 72h de crescimento em caldo AC e mostrou grande potencial para obtenção de composto com atividade antifúngica

Antifungal activity of actinomycetes against Bipolaris sorokininana isolates

Bipolaris sorokiniana é um fungo fitopatogênico do trigo e outras monocotiledôneas, que ocasiona moléstias como mancha marrom das folhas, podridão radicular e ponta preta dos grãos. Este fungo é capaz de sobreviver no solo ou em restos vegetais infectados sendo difícil eliminá-lo completamente das regiões agrícolas afetadas, assim, um sistema de controle do mesmo se faz necessário. Como o controle constante com fungicidas apresenta problemas ambientais e resistência do fitopatógeno, a utilização do controle biológico representa uma estratégia alternativa e com potencial. Bactérias do grupo dos actinomicetos são conhecidas por produzirem metabólitos secundários com grande potencial antibacteriano e antifúngico, assim, esse estudo tem como objetivo avaliar a atividade antifúngica de 25 isolados de Streptomyces sp. frente a 10 isolados do fungo Bipolaris sorokiniana. O Streptomyces sp. com maior potencial antifúngico foi selecionado através do ensaio de duplacamada. O ensaio de produção e otimização do composto antifúngico foi realizado utilizando os meios de cultura AC (amido caseína), ISP2 (4g extrato de levedura, 10g extrato de malte, 4g dextrose, água destilada para 1L), TSB (tripticaseína de soja) e Czapek-Dox. O isolado 1S inibiu 100% dos fungos no ensaio de dupla-camada, porém nas culturas líquidas não demonstrou a atividade fungicida esperada, possivelmente por estar presente em baixa concentração. Mais estudos devem ser realizados para encontrar as condições ideais para a produção do composto antifúngico do Streptomyces 1S.Bipolaris sorokiniana is a phytopathogenic fungus of wheat and other winter cereals. This phytopathogen is responsible for different diseases like spot blotch, common root rot, and black point of the grain. This fungus can survive in the soil or on infected plant debris, so that it is difficult to eliminate them completely from affected regions. For this reason it is necessary to improve the control system of the pathogen. So far the control is done using fungicides, but it presents environmental problems caused by chemical control and the phytopathogen acquires resistance to the products. Taking in account these considerations, the use of biological control represents a useful strategy. It is well known that bacteria from the actinomycetes group produces secondary metabolites such as antibacterial and antifungal potential; thereby this study aims to evaluate the antifungal activity of 25 strains of Streptomyces sp. against 10 isolates of the fungus Bipolaris sorokiniana. The Streptomyces with greater antifungal activity was selected by means of the double-layer method. Afterwards the optimization of production was done using submerse culture. For this purpose, AC (starch and casein broth), ISP2, TSB (trypticasein soya broth) and Czapek-Dox.. Isolate 1S inhibited 100% of the fungus in the double-layer assay; however, it didn’t show any fungicidal activity growing in submerse cultures. Further studies should be conducted to find the ideal conditions for producing the antifungal compound of strain Streptomyces 1S

Bioprospection of a potentially new antifungal substance produced by actinomycetes isolated on RS

Os fungos dermatófitos e as leveduras do gênero Candida são alguns dos microrganismos responsáveis por micoses em humanos. O tratamento dessas doenças acaba se tornando difícil pelo baixo número de antifúngicos existentes no mercado e pelo surgimento de resistência destes às drogas utilizadas. Já as actinobactérias são conhecidas por produzirem uma grande variedade de metabólitos secundários. Este trabalho teve como objetivo avaliar a atividade antifúngica dos metabólitos secundários produzidos por isolados de actinomicetos contra fungos dermatófitos e espécies de Candida sp. de origem clínica. Para a seleção dos isolados de actinomicetos com o melhor potencial de inibição foi realizado o ensaio de dupla camada em meio ágar amido caseína (ACA). Os isolados que mostraram atividade foram submetidos aos ensaios para a otimização da produção do composto ativo em sistema de cultura submersa. Para isso, foram avaliados diferentes meios de cultura, diferentes temperaturas e diferentes faixas de pH. A atividade antifúngica foi avaliada a cada 24h durante oito dias e observada através do ensaio de difusão em poço, onde foi calculado o índice de antibiose (IA). Nenhum dos isolados de fungos dermatófitos foi inibido no ensaio de dupla camada e os isolados 1S, R18(6) e 6(2) demonstraram atividade frente todas as espécies de Candida testadas. O isolado R18(6) mostrou melhor atividade em cultura líquida, sendo que as melhores condições de cultivo para a produção do antifúngico foi meio AC sem controle de pH, temperatura de 30°C e crescimento por 72h. Foram realizados ensaios como a concentração inibitória mínima, teste de termoestabilidade e avaliação do efeito de enzimas na atividade antifúngica do extrato bruto. O extrato bruto padronizado foi submetido à cromatografia de camada delgada (CCD) com diferentes solventes e o ensaio de autobiografia foi realizado para verificar a banda com atividade antifúngica. O composto ativo foi observado em um Rf de 0,35 quando utilizado como solvente a mistura de butanol/ ácido acético/ água. Após identificar a banda com atividade antifúngica foram realizados testes de coloração da CCD com cloreto férrico, ninhidrina e anisaldeído para identificação parcial do composto ativo. O resultado sugere que o composto não possui hidroxilas ligadas a anel aromático, não apresenta grupo amino livre e possivelmente alguma parte da molécula tenha um anel heterocíclico com nitrogênio ligado. Também, foi realizada a caracterização morfológica do isolado R18(6) através de microcultivo e microscopia eletrônica de varredura (MEV) e foram observadas estruturas características do gênero Streptomyces.The dermatophytes fungi and Candida species are some of the microorganisms responsible for mycoses in humans. The treatment of these diseases eventually becomes difficult by the low number of antifungal agents in the market and by the emergence of resistance to the drugs available today. The actinobacteria are known by producing different secondary metabolites. This study aimed to evaluate the antifungal activity of secondary metabolites produced by actinomycetes isolates against fungal pathogens of clinical origin. For the selection of actinomycetes isolates with the best potential inhibition the assay of double layer was performed on starch casein agar (SCA). The isolates that showed activity were submitted to an optimization of the active compound production in submerged culture system. In order to do so, different culture media, temperatures and pH ranges were assessed. The antifungal activity was evaluated every 24 hours for eight days and activity was observed by well diffusion assay, where the antibiosis index was calculated. None of the dermatophyte isolates were inhibited in the double layer assay. Isolates 1S, R18(6) and 6(2) of the actinobacteria demonstrated activity against all the tested Candida species. Isolate R18(6) showed the highest activity in liquid culture and the best growing conditions for producing the antifungal compound was media starch casein broth , without pH control, temperature of 30°C with 72h of cell growth. Assays were performed as the minimum inhibitory concentration, thermal stability test and the effect of different enzymes on antifungal activity of the crude extract. The crude extract was subjected to standardized thin layer chromatography (TLC) with different solvents and an autobiography assay was conducted to verify band with antifungal activity. The active compound was observed at an Rf of 0.35 when the solvent mixture of butanol/ acetic acid/ water was used. After identifying the band with antifungal activity CCD coloring tests were performed with ferric chloride, anisaldehyde and ninhydrin for partial identification of the active compound; it has been observed that the compound does not have hydroxyl groups attached to the aromatic ring, it has no free amino group and possibly some part of the molecule has a linked nitrogen heterocyclic ring. Also, we performed a morphological characterization of the isolate R18 (6) through microcultive and scanning electron microscopy and structures have been observed characteristics of the genus Streptomyces

Bioprospection of a potentially new antifungal substance produced by actinomycetes isolated on RS

Os fungos dermatófitos e as leveduras do gênero Candida são alguns dos microrganismos responsáveis por micoses em humanos. O tratamento dessas doenças acaba se tornando difícil pelo baixo número de antifúngicos existentes no mercado e pelo surgimento de resistência destes às drogas utilizadas. Já as actinobactérias são conhecidas por produzirem uma grande variedade de metabólitos secundários. Este trabalho teve como objetivo avaliar a atividade antifúngica dos metabólitos secundários produzidos por isolados de actinomicetos contra fungos dermatófitos e espécies de Candida sp. de origem clínica. Para a seleção dos isolados de actinomicetos com o melhor potencial de inibição foi realizado o ensaio de dupla camada em meio ágar amido caseína (ACA). Os isolados que mostraram atividade foram submetidos aos ensaios para a otimização da produção do composto ativo em sistema de cultura submersa. Para isso, foram avaliados diferentes meios de cultura, diferentes temperaturas e diferentes faixas de pH. A atividade antifúngica foi avaliada a cada 24h durante oito dias e observada através do ensaio de difusão em poço, onde foi calculado o índice de antibiose (IA). Nenhum dos isolados de fungos dermatófitos foi inibido no ensaio de dupla camada e os isolados 1S, R18(6) e 6(2) demonstraram atividade frente todas as espécies de Candida testadas. O isolado R18(6) mostrou melhor atividade em cultura líquida, sendo que as melhores condições de cultivo para a produção do antifúngico foi meio AC sem controle de pH, temperatura de 30°C e crescimento por 72h. Foram realizados ensaios como a concentração inibitória mínima, teste de termoestabilidade e avaliação do efeito de enzimas na atividade antifúngica do extrato bruto. O extrato bruto padronizado foi submetido à cromatografia de camada delgada (CCD) com diferentes solventes e o ensaio de autobiografia foi realizado para verificar a banda com atividade antifúngica. O composto ativo foi observado em um Rf de 0,35 quando utilizado como solvente a mistura de butanol/ ácido acético/ água. Após identificar a banda com atividade antifúngica foram realizados testes de coloração da CCD com cloreto férrico, ninhidrina e anisaldeído para identificação parcial do composto ativo. O resultado sugere que o composto não possui hidroxilas ligadas a anel aromático, não apresenta grupo amino livre e possivelmente alguma parte da molécula tenha um anel heterocíclico com nitrogênio ligado. Também, foi realizada a caracterização morfológica do isolado R18(6) através de microcultivo e microscopia eletrônica de varredura (MEV) e foram observadas estruturas características do gênero Streptomyces.The dermatophytes fungi and Candida species are some of the microorganisms responsible for mycoses in humans. The treatment of these diseases eventually becomes difficult by the low number of antifungal agents in the market and by the emergence of resistance to the drugs available today. The actinobacteria are known by producing different secondary metabolites. This study aimed to evaluate the antifungal activity of secondary metabolites produced by actinomycetes isolates against fungal pathogens of clinical origin. For the selection of actinomycetes isolates with the best potential inhibition the assay of double layer was performed on starch casein agar (SCA). The isolates that showed activity were submitted to an optimization of the active compound production in submerged culture system. In order to do so, different culture media, temperatures and pH ranges were assessed. The antifungal activity was evaluated every 24 hours for eight days and activity was observed by well diffusion assay, where the antibiosis index was calculated. None of the dermatophyte isolates were inhibited in the double layer assay. Isolates 1S, R18(6) and 6(2) of the actinobacteria demonstrated activity against all the tested Candida species. Isolate R18(6) showed the highest activity in liquid culture and the best growing conditions for producing the antifungal compound was media starch casein broth , without pH control, temperature of 30°C with 72h of cell growth. Assays were performed as the minimum inhibitory concentration, thermal stability test and the effect of different enzymes on antifungal activity of the crude extract. The crude extract was subjected to standardized thin layer chromatography (TLC) with different solvents and an autobiography assay was conducted to verify band with antifungal activity. The active compound was observed at an Rf of 0.35 when the solvent mixture of butanol/ acetic acid/ water was used. After identifying the band with antifungal activity CCD coloring tests were performed with ferric chloride, anisaldehyde and ninhydrin for partial identification of the active compound; it has been observed that the compound does not have hydroxyl groups attached to the aromatic ring, it has no free amino group and possibly some part of the molecule has a linked nitrogen heterocyclic ring. Also, we performed a morphological characterization of the isolate R18 (6) through microcultive and scanning electron microscopy and structures have been observed characteristics of the genus Streptomyces

Miltefosine as an alternative for the treatment of cryptococcosis: action mechanism and alginate nanoparticles as carriers.

Estudos prévios apontam que a miltefosina (MFS) pode ser uma alternativa como agente antifúngico; possui amplo espectro de ação e perfil fungicida; porém apresenta alta toxicidade. O uso de sistemas carreadores de fármacos a base de alginato tem ganhado lugar ao longo da última década. Assim, o presente trabalho visa entender os efeitos fisiológicos da MFS sobre as leveduras de Cryptococcus spp.; e, também, desenvolver uma formulação da MFS em nanopartículas de alginato (MFS.Alg) e posterior avaliação da eficácia antifúngica in vitro e em modelo murino de criptococose. Nossos resultados confirmam a atividade fungicida da MFS sobre Cryptococcus spp. e, também, mostram o efeito pós-antifúngico. Os efeitos fisiológicos causados nas leveduras sugerem que a MFS aumenta a permeabilidade da membrana plasmática via interação com o ergosterol, e também afeta a membrana mitocondrial, produzindo espécies reativas de oxigênio, fragmentação e condensação do DNA, levando a morte celular via apoptose. Com o intuito de reduzir os efeitos colaterais da MFS esta foi incorporada em nanopartículas de alginato (MFS.Alg), a formulação foi padronizada e caracterizada, obtendo tamanho médio de 314,0 ± 32,6 nm, índice de polidispersão em torno de 0,30 e potencial zeta de -27,2 ± 3,01 mV. Além disso, essas nanopartículas incorporam 81,7 ± 6,64 % do fármaco e a liberação da MFS é lenta e prolongada. A grande vantagem da MFS em nanopartículas de alginato é a redução da toxicidade quando comparado com a MFS livre. A atividade antifúngica in vitro da MFS.Alg é semelhante e até 10 vezes maior quando comparado ao fármaco livre. Em contraste, no modelo de criptococose sistêmica em camundongos, tanto a MFS livre como MFS.Alg aumentam a sobrevida dos animais quando comparado com o grupo não tratado; porém, somente o tratamento com a MFS.Alg reduz a carga fúngica nos pulmões e nos cérebros. Com os dados deste trabalho conseguimos elucidar mecanismos de ação da MFS em leveduras de Cryptococcus e, também, propor o uso de nanopartículas de alginato com MFS incorporada como uma potencial alternativa para tratamento da criptococose.Biomedical Sciences, University of São Paulo, São Paulo. Previous studies indicate that miltefosine (hexadecylphosphocholine, MFS) may be an alternative as an antifungal agent once that it has broad spectrum of action and fungicide profile; however, it presents high toxicity. The use of alginate-based drug delivery systems has been gaining ground over the last decade. Thus, the present project aims to understand the physiological effects of MFS on yeasts of Cryptococcus spp.; and develop a formulation of MFS in alginate nanoparticles (MFS.Alg) and subsequent evaluation of the antifungal efficacy in vitro and in the murine model of cryptococcosis. Our results confirm the fungicidal activity of MFS on Cryptococcus spp. and show the post-antifungal effect. Physiological effects on yeast suggest that MFS increases plasma membrane permeability through interaction with ergosterol and affects the mitochondrial membrane, producing reactive oxygen species, DNA fragmentation and condensation, leading to cell death via apoptosis. The MFS.Alg nanoparticles were standardized and characterized, having a mean size of 314.0 ± 32.6 nm, polydispersity index around 0.30 and zeta potential of -27.2 ± 3.01 mV. In addition, these nanoparticles incorporate 81.7 ± 6.64 % of the drug and the release of MFS is slow and protracted. The great advantage of MFS in alginate nanoparticles is the reduction of toxicity when compared to free MFS. The in vitro antifungal activity of MFS.Alg is similar and up to 10 times greater when compared to the free drug. In contrast, in the systemic cryptococcosis model in mice, both free MFS and MFS.Alg increase the survival of the animals when compared to the untreated group; however, only the treatment with MFS.Alg reduces the fungal load in the lungs and in the brains. With the data of this study, we elucidated the action mechanisms of MFS in Cryptococcus yeasts and also proposed the use of alginate nanoparticles with incorporated MFS as a potential alternative for the treatment of cryptococcosis