38 research outputs found
The peroxisomal WscA protein function in Aspergillus nidulans
Τα υπεροξεισώματα είναι μεταβολικά οργανίδια που εμπλέκονται σε διάφορες
σημαντικές λειτουργίες στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Μία από αυτές είναι το καλά
μελετημένο μονοπάτι καταβολισμού των πουρινών στον μύκητα Aspergillus nidulans,
καθώς ορισμένα από τα ένζυμα που συμμετέχουν σε αυτό βρίσκονται μέσα στα
υπεροξεισώματα. Εφόσον κάποια από τα βήματα του μονοπατιού πραγματοποιούνται
μέσα σε αυτά τα οργανίδια, ενώ άλλα στο κυτταρόπλασμα, είναι λογικό να διεξάγεται
μεταφορά των ενδιάμεσων μεταβολιτών κατά μήκος της υπεροξεισωμικής μεμβράνης.
Λαμβάνοντας υπόψη ότι οι μεταβολίτες αυτοί δεν μπορούν να διαχυθούν ελεύθερα
μέσω της λιπιδικής στοιβάδας των υπεροξεισωμάτων, ειδικοί μεταφορείς πρέπει να
βρίσκονται εκεί επιτελώντας αυτό το ρόλο. Για τον εντοπισμό τους πραγματοποιήσαμε
in silico αναζήτηση γονιδίων που ‘χάνονται’ εξελικτικά μαζί με την υπεροξεισωμική
οξειδάση του ουρικού οξέος (UOX) στους μύκητες. Κατά την αναζήτηση αυτή, οι
πρωτεΐνες της οικογένειας PMP22 εμφανίστηκαν ως οι καλύτεροι δυνατοί υποψήφιοι,
καθώς μερικές από αυτές λειτουργούν ως κανάλια σε μεμβράνες οργανιδίων. Για να
διερευνήσουμε αν τα PMP22 κανάλια έχουν πράγματι κάποιο ρόλο στη μεταφορά
ουρικού οξέος, αναλύσαμε τη λειτουργία της σχετικής πρωτεΐνης στο μύκητα Aspergillus
nidulans, την οποία ονομάσαμε WscA και η οποία κωδικοποιείται από το μη
χαρακτηρισμένο γονίδιο AN7258. Επιβεβαιώσαμε ότι η WscA βρίσκεται στη μεμβράνη
των υπεροξεισωμάτων και συνεντοπίζεται μαζί με mRFP συντηγμένη με
υπεροξεισωμικό πεπτίδιο οδηγό PTS1, την UOX και την HexA, η οποία είναι βασική
πρωτεΐνη εξειδικευμένων υπεροξεισωμάτων, των λεγόμενων σωματίων Woronin, τα
οποία φράσσουν τους πόρους των διαφραγμάτων στους νηματοειδείς ασκομύκητες. Η
γενετική διαγραφή του wscA γονιδίου οδήγησε σε αυξημένη ευαισθησία σε μεταβολικό ή
οξειδωτικό στρες, πιθανόν ως συνέπεια της παρατηρούμενης μείωσης στη βιογένεση
των υπεροξεισωμάτων αλλά και της ανικανότητας του συγκεκριμένου στελέχους να
φράξει τους πόρους των διαφραγμάτων. Παρ’ όλο το σχεδόν απόλυτο συνεντοπισμό
της WscA με την HexA, η διαγραφή του hexA γονιδίου δεν οδήγησε σε τέτοια αδυναμία
τοποθέτησης των υπεροξεισωμάτων στους πόρους των διαφραγμάτων, δείχνοντας
πως η WscA αποτελεί βασικό παράγοντα για αυτή τη διαδικασία. Επιπλέον, πληθώρα
δεδομένων αποδεικνύουν πως η WscΑ δεν ρυθμίζεται σε απόκκριση της παρουσίας
πουρινών και δεν είναι απαραίτητη για τη μεταφορά ουρικού οξέος, όπως είχαμε αρχικά
υποθέσει. Τα αποτελέσματά μας αναλύονται μέσα στο πλαίσιο προηγούμενων μελετών
για ομόλογες πρωτεΐνες της WscA σε άλλους νηματοειδείς μύκητες, καθώς σε ό,τι
αφορά στις παρατηρούμενες απώλειες των PMP22 και των υπεροξεισωμικών ενζύμων
που είναι απαραίτητα για τον καταβολσιμό του ουρικού οξέος.Peroxisomes are highly metabolic organelles involved in key functions in eukaryotic
cells. One of them is the well-studied purine assimilation pathway in Aspergillus
nidulans, where part of the purine catabolic enzymes is located inside peroxisomes.
Since certain steps of the pathway occur inside these organelles, while others in the
cytoplasm, there needs to be a transport of purine metabolites across the peroxisomal
membrane. As these intermediates are unable to diffuse freely through lipid bilayers,
specific transporters must exist for their passage membrane across the peroxisomal
membrane. In order to identify them, we conducted an in silico search for evolutionarily
correlated gene loss associated with fungal peroxisomal uric acid oxidase (UOX), where
PMP22-like proteins, found to be the most promising candidates, as some of them
function as promiscuous channels in organellar membranes. To investigate whether
PMP22 channels actually have a role in peroxisomal uric acid transport and catabolism,
we functionally analyzed the relevant Aspergillus nidulans protein, WscA, which is
encoded by the uncharacterized gene AN7258. We confirmed that WscA is a
peroxisomal membrane protein that co-localizes with PTS1-tagged mRFP, UOX or
HexA, the latter considered a protein of Woronin bodies (WBs), organelles originating
from peroxisomes that dynamically plug septal pores in filamentous ascomycetes. Our
results suggest that in A. nidulans, unlike some other ascomycetes, there is no strict
protein segregation of peroxisomal and WB-specific proteins. Importantly, genetic
deletion of wscA, but not of hexA, led to lack of peroxisomal localization at septal pores,
suggesting that WscA is a key factor for septal pore functioning. Additionally, ΔwscA
resulted in increased sensitivity to oxidative stress, apparently as a consequence of not
only the inability for septal pore plugging, but also a recorded reduction in peroxisome
biogenesis. However, deleting wscA had no effect on uric acid or purine utilization, as
we hypothesized, a result in also line with the observation that expression of WscA was
not affected by regulatory mutants and conditions known to control purine catabolic
enzymes. Our results are discussed within the frame of previous studies of WscA
homologues in other fungi, as well as, the observed gene losses of PMP22 and
peroxisomal uric acid oxidase
Ετερόλογη έκφραση θερμόφιλης εστεράσης και μελέτη της δράσης της σε υδατικά και μη υδατικά συστήματα
Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας ήταν η μελέτη της δράσης της εστεράσης του θερμόφιλου βακτηριακού στελέχους Geobacillus sp. SP50 σε υδατικά και μη υδατικά συστήματα. Στα πρώτα μελετήθηκε η ικανότητα υδρόλυσης εστέρων, ενώ στα δεύτερα η κατάλυση αντιδράσεων εστεροποίησης και μετεστεροποίησης από το συγκεκριμένο ένζυμο.
Αρχικά, το γονίδιο του συγκεκριμένου στελέχους ενισχύθηκε με τη χρήση PCR και κλωνοποιήθηκε σε κύτταρα E.coli DH5a. Έπειτα η ανασυνδυασμένη EstGsT1 εστεράση απομονώθηκε από επιδεκτικά κύτταρα E.coli BL21. Η παραγωγή της πραγματοποιήθηκε σε υγρές βακτηριακές καλλιέργειες με την προσθήκη IPTG, ως επαγωγέα της έκφρασης. Ο καθαρισμός της πρωτεΐνης έγινε σε στήλη Χρωματογραφίας Συγγένειας Ακινητοποιημένου Μετάλλου (IMAC), με ρητίνη ακινητοποιημένων ιόντων νικελίου. Το μοριακό της βάρος προσδιορίστηκε μέσω ηλεκτροφόρησης πηκτής πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) στα 28 kDa.
Ακολούθησε προσδιορισμός της πρωτεϊνικής συγκέντρωσης και της ενεργότητας της εστεράσης τόσο αμέσως μετά τον καθαρισμό όσο και μετά τις διαδικασίες της διαπίδυσης και της υπερδιήθησης με στόχο τη συμπύκνωση του ενζυμικού διαλύματος και τον καθαρισμό από περιεχόμενες ουσίες. Η τελική συγκέντρωση πρωτεΐνης στο πυκνό δείγμα ήταν ίση με 23 mg/mL, ενώ η ενεργότητα έναντι των ψευδοϋποστρωμάτων p-NPA και p-NPB ήταν 216 U/mL και 120 U/mL αντίστοιχα. Επιπλέον, διερευνήθηκε η βέλτιστη θερμοκρασία δράσης του ενζύμου, ελεύθερου και ακινητοποιημένου σε χιτοζάνη, αποδεικνύοντας πως όντως πρόκειται για ένα θερμόφιλο ένζυμο.
Για τη μελέτη των αντιδράσεων σύνθεσης, χρησιμοποιήθηκαν διάφορα μη συμβατικά συστήματα, βασισμένα στη χρήση οργανικών διαλυτών. Αυτά ήταν τα συμβατικά μικρογαλακτώματα, τα μικρογαλακτώματα χωρίς επιφανειοενεργό και το πήκτωμα χιτοζάνης, ως φορέας του ακινητοποιημένου ενζύμου. Σε ό,τι αφορά στα συμβατικά μικρογαλακτώματα και την υδρογέλη, τα οξέα που δοκιμάστηκαν ήταν αλειφατικά, ενώ στο άλλο σύστημα μελετήθηκε και η εστεροποίηση αρωματικών οξέων. Ωστόσο σε κανένα από τα συστήματα αυτά δεν εμφανίστηκε προϊόν κατά την αεριοχρωματογραφική ανάλυση. Οι αντιδράσεις υδρόλυσης μελετήθηκαν αφενός με ελεύθερο ένζυμο και αφετέρου με ένζυμο ακινητοποιημένο στο προαναφερθέν βιοπολυμερές. Στην πρώτη περίπτωση τα υποστρώματα ήταν εστέρες, η υδρόλυση των οποίων επιβεβαίωσε την καταλυτική δράση της εστεράσης. Το ένα εκ των δύο υποστρωμάτων, ο προπιονικός αιθυλεστέρας, λόγω της ταχύτατης υδρόλυσής του, χρησιμοποιήθηκε επίσης για την εύρεση του άριστου pH της εστεράσης. Στην περίπτωση όμως του ακινητοποιημένου ενζύμου, όπου μελετήθηκε η πιθανότητα υδρόλυσης εστέρων με περισσότερα άτομα άνθρακα, τα αποτελέσματα δεν ήταν το ίδιο θετικά.
Όλες οι αντιδράσεις σύνθεσης αναλύθηκαν με τη βοήθεια αέριου χρωματογράφου, όπως επίσης και οι αντιδράσεις υδρόλυσης με ελεύθερο ένζυμο. Αναφορικά, με τις αντιδράσεις σε υδατικό διάλυμα με ακινητοποιημένη την εστεράση, η ανάλυση πραγματοποιήθηκε με φωτομετρική μέθοδο.This dissertation focuses on the activity of the esterase of the thermophilic bacterial strain Geobacillus sp. SP50 in aqueous and non aqueous systems. In the first case, the hydrolytic activity of the enzyme was studied towards various esters and in the second case, the enzyme activity was studied towards esterification and transesterification reactions.
Initially, the gene of this specific strain was amplified using PCR and cloned into E.coli DH5a cells. Τhe recombinant esterase EstGsT1 was isolated and purified from competent E.coli BL21 cells. The production was performed in liquid cell cultures, with IPTG acting as an expression inducer. The expressed protein was purified in an Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) column with immobilized nickel ion resin. The molecular weight was estimated by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) to be equal to 28 kDa.
The next step included the determination of the protein concentration and the enzymatic activity both shortly after the purification and after the procedures of dialysis and ultrafiltration, which were performed in order to concentrate the enzymatic solution and get rid of any unwanted substances. The final protein concentration in the dense sample was equal to 23 mg/mL, while the activity towards the pseudosubstrates p-NPA and p-NPB was 216 U/mL and 120 U/mL respectively. Moreover, the optimal temperature was defined, using both free and immobilized on chitosan enzyme, verifying that the enzyme is thermophilic.
For the investigation of the enzymatic activity towards synthetic reactions, various non-conventional systems were tested, based on organic solvents. These included microemulsions, detergentless microemulsions and chitosan hydrogel, as a carrier of the immobilized enzyme. Concerning the conventional microemulsions and the hydrogel, the acids that were used as substrates were aliphatic, while in the case of detergentless microemulsions, esterification of aromatic acids was also tested. However none of the above systems exhibited any ester production, as detected by chromatographic analysis. The activity of the enzyme towards hydrolytic reactions was examined using free as well as immobilized enzyme, on the same biopolymer mentioned above. In the first case, the substrates, which were esters, were hydrolyzed efficiently, confirming the esterase’s catalytic activity. One of the tested substrates, ethyl propionate, was also used for the determination of the optimal pH, due to its fast hydrolysis. Nevertheless, in the case of the immobilized enzyme, where esters with more carbon atoms in their chain were used as reagents, the results weren’t so positive.
All of the synthetic reactions were analyzed by gas chromatography, as well as the hydrolysis based upon the free esterase. Regarding the reactions in aqueous solutions with the use of immobilized enzyme, the analysis was performed according to a photometric metho
Tissue-specific genetic variation suggests distinct molecular pathways between body shape phenotypes and colorectal cancer
It remains unknown whether adiposity subtypes are differentially associated with colorectal cancer (CRC). To move beyond single-trait anthropometric indicators, we derived four multi-trait body shape phenotypes reflecting adiposity subtypes from principal components analysis on body mass index, height, weight, waist-to-hip ratio, and waist and hip circumference. A generally obese (PC1) and a tall, centrally obese (PC3) body shape were both positively associated with CRC risk in observational analyses in 329,828 UK Biobank participants (3728 cases). In genome-wide association studies in 460,198 UK Biobank participants, we identified 3414 genetic variants across four body shapes and Mendelian randomization analyses confirmed positive associations of PC1 and PC3 with CRC risk (52,775 cases/45,940 controls from GECCO/CORECT/CCFR). Brain tissue-specific genetic instruments, mapped to PC1 through enrichment analysis, were responsible for the relationship between PC1 and CRC, while the relationship between PC3 and CRC was predominantly driven by adipose tissue-specific genetic instruments. This study suggests distinct putative causal pathways between adiposity subtypes and CRC
The evolving landscape of COVID‐19 and post‐COVID condition in patients with chronic lymphocytic leukemia: A study by ERIC, the European research initiative on CLL
In this retrospective international multicenter study, we describe the clinical characteristics and outcomes of patients with chronic lymphocytic leukemia (CLL) and related disorders (small lymphocytic lymphoma and high-count monoclonal B lymphocytosis) infected by SARS-CoV-2, including the development of post-COVID condition. Data from 1540 patients with CLL infected by SARS-CoV-2 from January 2020 to May 2022 were included in the analysis and assigned to four phases based on cases disposition and SARS-CoV-2 variants emergence. Post-COVID condition was defined according to the WHO criteria. Patients infected during the most recent phases of the pandemic, though carrying a higher comorbidity burden, were less often hospitalized, rarely needed intensive care unit admission, or died compared to patients infected during the initial phases. The 4-month overall survival (OS) improved through the phases, from 68% to 83%, p = .0015. Age, comorbidity, CLL-directed treatment, but not vaccination status, emerged as risk factors for mortality. Among survivors, 6.65% patients had a reinfection, usually milder than the initial one, and 16.5% developed post-COVID condition. The latter was characterized by fatigue, dyspnea, lasting cough, and impaired concentration. Infection severity was the only risk factor for developing post-COVID. The median time to resolution of the post-COVID condition was 4.7 months. OS in patients with CLL improved during the different phases of the pandemic, likely due to the improvement of prophylactic and therapeutic measures against SARS-CoV-2 as well as the emergence of milder variants. However, mortality remained relevant and a significant number of patients developed post-COVID conditions, warranting further investigations
COVID-19 severity and mortality in patients with CLL: an update of the international ERIC and Campus CLL study
Patients with chronic lymphocytic leukemia (CLL) may be more susceptible to Coronavirus disease 2019 (COVID-19) due to age, disease, and treatment-related immunosuppression. We aimed to assess risk factors of outcome and elucidate the impact of CLL-directed treatments on the course of COVID-19. We conducted a retrospective, international study, collectively including 941 patients with CLL and confirmed COVID-19. Data from the beginning of the pandemic until March 16, 2021, were collected from 91 centers. The risk factors of case fatality rate (CFR), disease severity, and overall survival (OS) were investigated. OS analysis was restricted to patients with severe COVID-19 (definition: hospitalization with need of oxygen or admission into an intensive care unit). CFR in patients with severe COVID-19 was 38.4%. OS was inferior for patients in all treatment categories compared to untreated (p < 0.001). Untreated patients had a lower risk of death (HR = 0.54, 95% CI:0.41–0.72). The risk of death was higher for older patients and those suffering from cardiac failure (HR = 1.03, 95% CI:1.02–1.04; HR = 1.79, 95% CI:1.04–3.07, respectively). Age, CLL-directed treatment, and cardiac failure were significant risk factors of OS. Untreated patients had a better chance of survival than those on treatment or recently treated
Cabbage and fermented vegetables : From death rate heterogeneity in countries to candidates for mitigation strategies of severe COVID-19
Large differences in COVID-19 death rates exist between countries and between regions of the same country. Some very low death rate countries such as Eastern Asia, Central Europe, or the Balkans have a common feature of eating large quantities of fermented foods. Although biases exist when examining ecological studies, fermented vegetables or cabbage have been associated with low death rates in European countries. SARS-CoV-2 binds to its receptor, the angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2). As a result of SARS-CoV-2 binding, ACE2 downregulation enhances the angiotensin II receptor type 1 (AT(1)R) axis associated with oxidative stress. This leads to insulin resistance as well as lung and endothelial damage, two severe outcomes of COVID-19. The nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (Nrf2) is the most potent antioxidant in humans and can block in particular the AT(1)R axis. Cabbage contains precursors of sulforaphane, the most active natural activator of Nrf2. Fermented vegetables contain many lactobacilli, which are also potent Nrf2 activators. Three examples are: kimchi in Korea, westernized foods, and the slum paradox. It is proposed that fermented cabbage is a proof-of-concept of dietary manipulations that may enhance Nrf2-associated antioxidant effects, helpful in mitigating COVID-19 severity.Peer reviewe
Nrf2-interacting nutrients and COVID-19 : time for research to develop adaptation strategies
There are large between- and within-country variations in COVID-19 death rates. Some very low death rate settings such as Eastern Asia, Central Europe, the Balkans and Africa have a common feature of eating large quantities of fermented foods whose intake is associated with the activation of the Nrf2 (Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2) anti-oxidant transcription factor. There are many Nrf2-interacting nutrients (berberine, curcumin, epigallocatechin gallate, genistein, quercetin, resveratrol, sulforaphane) that all act similarly to reduce insulin resistance, endothelial damage, lung injury and cytokine storm. They also act on the same mechanisms (mTOR: Mammalian target of rapamycin, PPAR gamma:Peroxisome proliferator-activated receptor, NF kappa B: Nuclear factor kappa B, ERK: Extracellular signal-regulated kinases and eIF2 alpha:Elongation initiation factor 2 alpha). They may as a result be important in mitigating the severity of COVID-19, acting through the endoplasmic reticulum stress or ACE-Angiotensin-II-AT(1)R axis (AT(1)R) pathway. Many Nrf2-interacting nutrients are also interacting with TRPA1 and/or TRPV1. Interestingly, geographical areas with very low COVID-19 mortality are those with the lowest prevalence of obesity (Sub-Saharan Africa and Asia). It is tempting to propose that Nrf2-interacting foods and nutrients can re-balance insulin resistance and have a significant effect on COVID-19 severity. It is therefore possible that the intake of these foods may restore an optimal natural balance for the Nrf2 pathway and may be of interest in the mitigation of COVID-19 severity
Μηχανισμοί υποκυτταρικής διακίνησης, λειτουργίας και μοριακής εξέλιξης μεταφορέων
Plasma membrane (PM) proteins mediating cell nutrition, communication and adaptation to physiological or stress signals are essential to all organisms. In eukaryotic cells, the first step in their biogenesis is their co-translational translocation from ribosomes to the membrane of the endoplasmic reticulum (ER). According to the current belief, PM proteins exit the ER in COPII vesicles that fuse to the cis-Golgi and then reach the trans-Golgi network via Golgi maturation, before being dispatched to the PM. Fusion between vesicular intermediates and target membranes is mediated by soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptors (SNAREs), tethering proteins, small GTPases and other regulatory factors. This trafficking route, often referred to as conventional protein secretion, is considered to be the major pathway for translocation of most membrane proteins to the PM. However, emerging evidence from different groups has challenged aspects of the conventional trafficking route of membrane cargoes. More specifically, in several cases, specific cargoes have been shown to follow unconventional protein secretion (UPS), bypassing vesicular secretion or sorting via the Golgi apparatus, on their way to the PM. Surprisingly, there are only a few studies following the biogenesis of the most abundant PM proteins, such as transporters, receptors or channels.Filamentous fungi, such as Aspergillus nidulans, Neurospora crassa or Ustilago maydis, have emerged as powerful model organisms for performing in vivo cell biology studies. Due to their polar mode of growth, and similar to most polar cells in animals and plants, filamentous fungi need to regulate the targeting and distribution of membrane proteins to specific apical or basolateral areas of the PM. For example, as our lab has showed, nutrient transporters of A. nidulans are distributed homogeneously all along the PM, whereas membrane proteins involved in apical growth are polarly positioned and maintained at the growing tip of hyphae cells. Furthermore, we have shown, along with other fungal groups, that the polarly localized apical membrane proteins of A. nidulans follow the conventional, Golgi-dependent, secretory route to be sorted to the apex of growing hyphae, similar to findings in yeast and polar mammalian cells. In contrast, no studies, in filamentous fungi, yeast or any other system, have examined how nutrient transporters or other non-polarly positioned cargoes translocate to the PM.In the first part of the present thesis, we developed a novel genetic system to study the anterograde trafficking of nutrient transporters in A. nidulans. Using as our principal non-polar membrane cargo the well-studied uric-acid/xanthine transporter UapA, but also other transporters, we obtained experimental evidence that the trafficking of neosynthesized transporters, after COPII-dependent exit from the ER, occurs via ‘Golgi-bypass’. These surprising findings strongly suggest the existence of distinct, cargo-specific, ER-exit mechanisms and/or alternative COPII subpopulations. In the second part of the thesis, we extended our experimental approach to essential PM proteins, such as the proton pump PmaA and the pH signaling component PalI, which differ significantly from nutrient transporters in several aspects in terms of structure and physiologic function, but also show a non-polar distribution at the PM. We showed that these cargoes, similar to transporters, also bypass the Golgi during their biosynthesis, which in turn suggests that all non-polar cargoes might be translocated to the PM via a Golgi-independent mechanism.In the third part of this thesis, we searched for proteins that might be critical for the discrimination between Golgi-independent and Golgi-dependent trafficking routes. As a first approach, we performed a series of genetic screens, using as a model Golgi-bypasser the UapA transporter, whose mislocalization from the PM could be easily monitored by growth tests on media containing its physiological substrate, uric acid, as sole nitrogen source or toxic analogues. Through these genetic screens, we selected mostly transcriptional or translational mutations leading to the non-expression of UapA. Unfortunately, we did not obtain any mutation affecting the trafficking of UapA to the PM. These results point to the idea that factors involved in Golgi-bypass might be essential for cell survival, so that, future genetic screens should be re-designed in order to select conditional or hypomorphic trafficking mutations. As an alternative unbiased approach to identify proteins involved in Golgi-bypass of transporters or other membrane proteins, we employed a proximity-dependent biotinylation method (PDB) coupled to proteomic analysis. This is expected in principle, to identify proteins that might interact transiently with UapA in the course of ER-exit and eventual translocation to the PM. Optimization of this assay during the present thesis lays the foundation for the identification of transient UapA interactors in the very near future. As a third approach, we also performed a systematic analysis of several proteins already known to be implicated in the conventional trafficking process. This analysis revealed that Sec12 and Ykt6, which participate in COPII biogenesis and membrane fusion, respectively, are indeed critical in the discrimination between the Golgi-dependent and Golgi-independent mechanism of membrane trafficking.In the fourth part of the thesis, we employed Photoactivated Localization Microscopy (PALM), a super-resolution microscopy technique, to perform a finer analysis of the dynamics of UapA-containing carriers during trafficking. We thus confirmed the dispensability of key Golgi-effectors (SedV, RabE) and the essentiality of the Qa-SNARE SsoA for the trafficking of this model Golgi-bypasser. In addition, we showed the super-fast (< 1 s) and short-distance (<1 μΜ) movement of cargoes that use Golgi-bypass to be sorted to the PM, in contrast to the long-distance and easily-tracked transport of conventionally secreted cargoes across the microtubule tracks.In summary, through this work, we discovered a novel, Golgi-independent, trafficking pathway driving the biogenesis of non-polarly positioned transmembrane proteins in A. nidulans, and we gained insight into some of the characteristics of this newly-identified trafficking route. Notably, our findings point to the idea that Golgi-bypass might not constitute a fungal-specific peculiarity, but rather be a novel major and cargo-specific sorting route in eukaryotic cells that has been largely ignored.Οι πρωτεΐνες της πλασματικής μεμβράνης είναι απαραίτητες σε όλους τους οργανισμούς, καθώς μεσολαβούν στην πρόσληψη θρεπτικών, την επικοινωνία των κυττάρων αλλά και την απόκριση σε φυσιολογικά ερεθίσματα ή στρεσογόνους παράγοντες. Στα ευκαρυωτικά κύτταρα, το πρώτο βήμα στη βιογένεσή τους είναι η συμμεταφραστική τους μετατόπιση από τα ριβοσώματα στη μεμβράνη του ενδοπλασματικού δικτύου (ΕΔ). Σύμφωνα με την τρέχουσα γνώση, οι πρωτεΐνες της πλασματικής μεμβράνης εξέρχονται από το ΕΔ μέσα σε κυστίδια COPII, τα οποία συντήκονται στο cis-Golgi και έπειτα φτάνουν μέσω ωρίμανσης του συμπλέγματος Golgi στο trans-Golgi, από όπου αποστέλλονται στην πλασματική μεμβράνη. Η διαμεσολαβούμενη σύντηξη κυστιδιακών δομών και μεμβρανών-στόχων πραγματοποιείται από πρωτεΐνες SNAREs, πρωτεΐνες πρόσδεσης, μικρές GTPases και άλλους ρυθμιστικούς παράγοντες. Αυτή η οδός διακίνησης, που συχνά αναφέρεται ως συμβατική οδός έκκρισης πρωτεϊνών, θεωρείται ως το κύριο μονοπάτι για την υποκυτταρική διακίνηση των περισσότερων πρωτεϊνών της πλασματικής μεμβράνης. Ωστόσο, νέα δεδομένα από διαφορετικές ερευνητικές ομάδες έχουν αρχίσει να αμφισβητούν πτυχές της συμβατικής οδού διακίνησης των μεμβρανικών πρωτεϊνών. Συγκεκριμένα, σε αρκετές περιπτώσεις, έχει δειχθεί ότι κάποιες πρωτεΐνες ακολουθούν μια μη-συμβατική οδό, παρακάμπτοντας την έκκριση μέσω κυστιδίων ή τη διακίνησή μέσω του συμπλέγματος Golgi, στην πορεία τους προς την πλασματική μεμβράνη. Παραδόξως, ελάχιστες έρευνες έχουν μελετήσει τον μηχανισμό βιογένεσης των πιο άφθονων πρωτεϊνών της πλασματικής μεμβράνης, όπως των μεταφορέων, των υποδοχέων ή των καναλιών.Οι νηματοειδείς μύκητες, όπως οι Aspergillus nidulans, Neurospora crassa ή Ustilago maydis, έχουν αναδειχθεί ως πρότυποι οργανισμοί για την in vivo διεξαγωγή πειραμάτων κυτταρικής βιολογίας. Λόγω του πολικού τρόπου ανάπτυξής τους, όπως συμβαίνει και στα περισσότερα πολικά κύτταρα ζώων και φυτών, οι νηματοειδείς μύκητες πρέπει να ρυθμίσουν τη στόχευση και την κατανομή των πρωτεϊνών σε συγκεκριμένες περιοχές της κορυφαίας ή της πλαγιοβασικής μεμβράνης. Για παράδειγμα, όπως έχουμε δείξει στο εργαστήριό μας, οι μεταφορείς θρεπτικών ουσιών στον A. nidulans είναι ομοιογενώς κατανεμημένοι καθ’ όλο το μήκος της πλασματικής μεμβράνης, ενώ οι μεμβρανικές πρωτεΐνες που συμμετέχουν στην αύξηση τοποθετούνται πολικά και διατηρούνται στην αναπτυσσόμενη άκρη των υφών. Επιπλέον, έχουμε δείξει, όπως και άλλες ομάδες που μελετούν νηματοειδείς μύκητες, ότι οι πρωτεΐνες που τοποθετούνται πολικά στην ακραία περιοχή της πλασματικής μεμβράνης του A. nidulans ακολουθούν τη συμβατική, εξαρτώμενη από το σύμπλεγμα Golgi, εκκριτική οδό, όπως άλλωστε συμβαίνει και σε ζύμες και πολικά κύτταρα θηλαστικών. Αντιθέτως, καμία μελέτη σε νηματοειδείς μύκητες, ζύμες ή κάποιο άλλο σύστημα, δεν έχει εξετάσει πώς διακινούνται στην πλασματική μεμβράνη οι μεταφορείς θρεπτικών ουσιών ή άλλες μεμβρανικές πρωτεΐνες που δεν εμφανίζουν πολική κατανομή.Στο πρώτο μέρος της παρούσας διατριβής, αναπτύξαμε ένα νέο γενετικό σύστημα για τη μελέτη της διακίνησης διαμεμβρανικών μεταφορέων θρεπτικών ουσιών στον A. nidulans. Χρησιμοποιώντας ως πρότυπο μη-πολικής μεμβρανικής πρωτεΐνης τον εξαιρετικά μελετημένο μεταφορέα ουρικού οξέος/ξανθίνης UapA, αλλά στη συνέχεια και άλλους μεταφορείς, συλλέξαμε πειραματικά στοιχεία που δείχνουν ότι η διακίνηση νεοσυντιθέμενων μεταφορέων, μετά την έξοδο από το ΕΔ σε κυστίδια COPII, πραγματοποιείται μέσω ενός μηχανισμού που παρακάμπτει το σύμπλεγμα Golgi. Αυτά τα απροσδόκητα αποτελέσματα υποστηρίζουν σθεναρά την ύπαρξη διακριτών μηχανισμών εξόδου από το ΕΔ, ειδικών για την εκάστοτε πρωτεΐνη ή/και εναλλακτικών πληθυσμών κυστιδίων COPII. Στο δεύτερο μέρος της διατριβής, επεκτείναμε την πειραματική μας προσέγγιση σε ζωτικής σημασίας πρωτεΐνες της πλασματικής μεμβράνης, όπως η αντλία πρωτονίων PmaA και η σχετιζόμενη με τη ρύθμιση του pH πρωτεΐνη PalI, οι οποίες διαφέρουν από τους μεταφορείς θρεπτικών ουσιών σε πολλούς τομείς, σχετικούς με τη δομή και τη φυσιολογική λειτουργία τους, διατηρώντας όμως και αυτές μια μη πολική κατανομή στην πλασματική μεμβράνη. Δείξαμε ότι οι πρωτεΐνες αυτές, όπως και οι μεταφορείς, παρακάμπτουν το σύμπλεγμα Golgi κατά τη βιοσύνθεσή τους, γεγονός που υποδηλώνει ότι όλες οι πρωτεΐνες που είναι μη-πολικά κατανεμημένες στην πλασματική μεμβράνη διακινούνται μέσω ενός μη-συμβατικού μηχανισμού ανεξάρτητου του Golgi.Στο τρίτο μέρος της διδακτορικής διατριβής, αναζητήσαμε πρωτεΐνες που μπορεί να είναι σημαντικές για τη διάκριση μεταξύ της ανεξάρτητης και της εξαρτώμενης από το Golgi οδού διακίνησης πρωτεϊνών. Ως πρώτη προσέγγιση, πραγματοποιήσαμε μια σειρά γενετικών πειραμάτων διαλογής μεταλλαγών χρησιμοποιώντας ως πρότυπη μη-συμβατικά εκκρινόμενη πρωτεΐνη τον μεταφορέα UapA του οποίου περιπτώσεις ελλαττωματικής στόχευσης στη μεμβράνη είναι δυνατόν να αναγνωριστούν μέσω μη-φυσιολογικής ανάπτυξης σε θρεπτικό μέσο που εμπεριέχει υποστρώματα (π.χ. ουρικό οξύ) η τοξικά ανάλογα υποστρωμάτων του μεταφορέα. Ωστόσο, μέσω αυτών των γενετικών πειραμάτων, απομονώσαμε κυρίως μεταγραφικές ή μεταφραστικές μεταλλαγές που οδηγούν στη μη-έκφραση του UapA. Δυστυχώς, δεν πήραμε καμία μεταλλαγή που να επηρεάζει τη διακίνηση του UapA στην πλασματική μεμβράνη. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ότι οι παράγοντες που εμπλέκονται στο μονοπάτι που παρακάμπτει το σύμπλεγμα Golgi φαίνεται να είναι απαραίτητοι για την επιβίωση του κυττάρου, και έτσι μελλοντικά αντίστοιχα πειράματα θα πρέπει να επανασχεδιαστούν με σκοπό την επιλογή μεταλλαγών που οδηγούν σε υπομορφικούς φαινοτύπους (conditional ή hypomorphic). Σαν εναλλακτική προσέγγιση για τον εντοπισμό πρωτεϊνών που μπορεί να εμπλέκονται στο μονοπάτι που παρακάμπτει το σύμπλεγμα Golgi, χρησιμοποιήσαμε τη μέθοδο Proximity Dependent Biotinylation (PDB) σε συνδυασμό με πρωτεομική ανάλυση. Κατά βάση αναμέναμε να εντοπίσουμε πρωτεΐνες που αλληλοεπιδρούν παροδικά με τον UapΑ κατά τη διάρκεια της διαδρομής του από το ΕΔ στην πλασματική μεμβράνη. Η βελτιστοποίηση αυτής της τεχνικής κατά τη διάρκεια της παρούσας διατριβής έχει ήδη θέσει τα θεμέλια για να τον εντοπισμό των προαναφερθέντων πρωτεϊνών. Ως τρίτη προσέγγιση, πραγματοποιήσαμε μια συστηματική ανάλυση πρωτεϊνών που είναι ήδη γνωστό ότι εμπλέκονται στη συμβατική διαδικασία πρωτεϊνικής διακίνησης. Η ανάλυση αυτή αποκάλυψε ότι οι πρωτεΐνες Sec12 και Ykt6, που συμμετέχουν στη βιογένεση των COPII κυστιδίων και στη σύντηξη μεμβρανών, αντίστοιχα, είναι πράγματι σημαντικές για τη διάκριση μεταξύ του μονοπατιού που εξαρτάται από το σύμπλεγμα Golgi και αυτού που το παρακάμπτει.Στο τέταρτο μέρος της διατριβής, χρησιμοποιήσαμε τεχνική μικροσκοπίας υψηλής ευκρίνειας, συγκεκριμένα την Photoactivated Localization Microscopy (PALM), με σκοπό την λεπτομερή ανάλυση των μεμβρανικών δομών που διακινούν τον μεταφορέα UapA. Μέσω αυτής επιβεβαιώσαμε ότι οι βασικοί τελεστές του συμπλέγματος Golgi (SedV, RabE) είναι περιττοί ενώ η Qa-SNARE SsoA είναι απολύτως αναγκαία για την τελική μετατόπιση του UapA στην πλασματική μεμβράνη. Επιπλέον, δείξαμε ότι οι μεμβρανικές δομές που εμπεριέχουν τον UapA παρακάμπτουν το σύμπλεγμα Golgi επιτελούν μια ταχύτατη (< 1 s) και σύντομη (< 1 μΜ) μετακίνηση προς την πλασματική μεμβράνη, σε αντίθεση με τους φορείς που εκκρίνονται μέσω του συμβατικού μονοπατιού, οι οποίοι διανύουν σημαντικές αποστάσεις κατά τη μεταφορά τους πάνω σε μικροσωληνίσκους, και κατ’ επέκταση εύκολα ανιχνεύσιμες.Συνοψίζοντας, μέσα από αυτήν την εργασία, ανακαλύψαμε ένα νέο μονοπάτι για τη διακίνηση διαμεμβρανικών μη-πολικά κατανεμημένων πρωτεϊνών στον A. nidulans το οποίο είναι ανεξάρτητο από το σύμπλεγμα Golgi και αποκτήσαμε μια εικόνα για ορισμένα από τα χαρακτηριστικά του. Τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν ότι η παρακαμπτήρια από το σύμπλεγμα Golgi οδός φαίνεται να μην αποτελεί απλά μια ιδιαιτερότητα των μυκήτων, αλλά πιθανόν μία νέα βασική και οδό διακίνησης, εξειδικευμένη για την εκάστοτε πρωτεΐνη, στα ευκαρυωτικά κύτταρα, που μέχρι τώρα έχει αγνοηθεί
Assessing forestry-related musculoskeletal symptoms in specific body areas
The aim of the current study is to determine and analyze the prevalence among forestry workers of self-reported musculoskeletal disorder symptoms (MSSs) in specific areas of the body. The Standardized Nordic Questionnaire (SNQ) was used, which was specifically modified and adapted for the assessment of lower back, neck, and shoulder symptoms. The questionnaire was completed by 100 professional forestry workers, who were divided into four groups according to their distinct work duties. Almost 50% of the participants reported that they had experienced some kind of problem in their lower back, neck or shoulder at least once during their entire professional life. The results also show that forestry workers who perform motor-manual felling with chainsaws and skidding with the use of mules present the highest frequency of complaints in the lower back and shoulder. An additional finding is that the increase in the length of work experience is positively associated with a reduction in the occurrence of symptoms in the three examined body parts; in other words, the longer the work experience, the more proper and efficient the execution of timber harvesting tasks and duties, since these job skills are acquired only through experience in Greece. More generally, the factor years of experience has been found to constitute the most important parameter in explaining the variations in the musculoskeletal symptoms among forestry workers
Monitoring self-reported musculoskeletal symptoms in forestry operations
Tough working conditions prevailing in the silvicultural sector contribute to the appearance of musculoskeletal disorders (MSDs) in employees. This paper presents an analysis of the prevalence of self-reported musculoskeletal disorder symptoms (MSSs) among forestry workers. The Standardized Nordic Questionnaire (SNQ) was used as a tool for recording such self-reported symptoms. The questionnaire was completed by 100 professional forestry workers, 29 of whom were female, whose main tasks included debarking and stacking of firewood. The 71 male participants were classified according to work type into those who performed motor-manual felling and skidding with draft animals and those who performed motor-manual felling and skidding with the use of agricultural tractors. In order to test for the potential effects of different factors on the prevalence of MSSs among the workers, a quasi-binomial regression approach was followed. The main outcome from the fit of the regression-type models was that besides the varying influence of demographic factors such as workers’ age and years of experience, the type of work also constitutes a major factor impacting MSSs. Furthermore, the results show that the self-reported MSSs that occurred in the overall number of participants over the last 12 months preceding the completion of the questionnaire affected body areas such as wrists and hands (65%), knees (57%), and lower back (52%). A high percentage (41%) of participants also reported symptoms on their shoulders and upper back