Characterization of the Roc Two-component systems in Pseudomonas aeruginosa : a complex regulatory network

Pseudomonas aeruginosa est une bactérie à Gram négatif à caractère ubiquitaire que l’on retrouve dans une grande diversité d’environnements. C’est un pathogène opportuniste qui est responsable chez l’homme d’infections chroniques ou aigües qui peuvent être mortelles pour des patients immuno-déficients. L’établissement d’une infection chronique est généralement associé à la capacité de la bactérie à former un biofilm, qui se définit comme une population bactérienne attachée sur une surface et englobée par une matrice extracellulaire formée entre autre depolysaccharides. La formation du biofilm est un processus bien défini dans le temps et dans l’espace et qui implique la mise en jeu de nombreuses structures de surfaces dont l’assemblage est strictement contrôlé. Une des voies de régulation contrôlant cet assemblage est le système à 2composants Roc1 (« regulation of cup genes »). Les gènes cup codent des composants de la voie « chaperone-usher » qui permet le transport de sous-unités pilines et leur assemblage à la surface bactérienne sous forme de pili. Ces pili Cup sont important dans l’établissement du biofilm. Le système Roc1 est aussi impliqué dans la mise en place du système de sécrétion de type III, qui est communément associé aux infections aigues. De fait le système Roc1 peut être considéré comme un «interrupteur» décidant du mode d’infection associé à P. aeruginosa. Le système Roc1 est constitué d’un senseur non-orthodoxe (RocS1) et de deux régulateurs de réponse, RocA1 et RocR, dont le domaine effecteur est un domaine de liaison à l’ADN ou un domaine EAL à activité phosphodiesterase, respectivement. Il existe également d’autres gènes paralogues de Roc1 qui sont le système Roc2 avec RocS2 et RocA2 très similaire à RocS1 et RocA1, ainsi que RocS3 similaire à RocS1. Le travail réalisé au cours de ma thèse a montré qu’il existe une régulation croisée entre Roc1 etRoc2. Cependant, chacune des branches du réseau de régulation contrôle l’expression d’une série de gènes bien spécifiques. Nous avons montré que la signalisation via RocS2 et RocS1 lorsqu’elle converge sur RocA1 contrôle l’expression des gènes cupC et ce contrôle est totalement indépendantde RocA2. Par contre lorsque la signalisation RocS1 et RocS2 converge vers RocA2 alors ce sont les gènes mexAB-oprM, qui codent une pompe d’efflux impliquée dans la résistance aux antibiotiques, dont l’expression est alors réprimée.En conclusion, nous avons mis en évidence un modèle unique de régulation croisée qui résulte dans un effet antagoniste entre formation du biofilm et résistance aux antibiotiques. Si cela peut paraître inattendu, quelques données cliniques sont en faveur d’une telle balance. En effet, l’analyse de souches de P. aeruginosa, isolées à partir de patients atteints de mucoviscidose, révèle que dans ces isolats la pompe MexAB-OprM est inactive. La raison de cette adaptation n’est pas élucidée, mais l’absence de pompe fonctionnelle pourrait procurer un avantage, une meilleure aptitude à la souche à persister dans cet environnement. Il est également reconnu que dans les poumons de ces patients le mode préféré de développement pour P. aeruginosa est le biofilm. Mises bout à bout ces observations suggèrent donc que le système Roc pourrait être un système de régulation important pour percevoir l’environnement du poumon chez le patient mucoviscidosique et déclencher une réponse adaptée.The opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa is responsible for diverse chronic and acute infections in human. Chronic infections are associated with the capacity of P. aeruginosa to form biofilms. One of the pathways controlling biofilm formation is the Roc1 two-component system, involved in the regulation of cup genes allow the assembly of thin fimbriae at the surface of the bacterium. Cup fimbiae are important in biofilm formation. There exist paralogues of the Roc1 system - the Roc2 and Roc3 system. The work in this thesis has shown that cross-regulation occurs between Roc1 and Roc2. However, each branch in this network appears to control the expression of a specific subset of genes whose role and functions are striking in the context of an infection process. We characterized here a unique model of cross-regulation which results in the antagonistic regulation of biofilm formation and antibiotic resistanc

Characterization of the Roc Two-component systems in Pseudomonas aeruginosa (a complex regulatory network)

Pseudomonas aeruginosa est une bactérie à Gram négatif à caractère ubiquitaire que l on retrouve dans une grande diversité d environnements. C est un pathogène opportuniste qui est responsable chez l homme d infections chroniques ou aigües qui peuvent être mortelles pour des patients immuno-déficients. L établissement d une infection chronique est généralement associé à la capacité de la bactérie à former un biofilm, qui se définit comme une population bacte rienne attachée sur une surface et englobée par une matrice extracellulaire formée entre autre depolysaccharides. La formation du biofilm est un processus bien défini dans le temps et dans l espace et qui implique la mise en jeu de nombreuses structures de surfaces dont l assemblage est strictement contrôlé. Une des voies de régulation contrôlant cet assemblage est le système à 2composants Roc1 ( regulation of cup genes ). Les gènes cup codent des composants de la voie chaperone-usher qui permet le transport de sous-unités pilines et leur assemblage à la surface bactérienne sous forme de pili. Ces pili Cup sont important dans l établissement du biofilm. Le système Roc1 est aussi impliqué dans la mise en place du système de sécrétion de type III, qui est communément associé aux infections aigues. De fait le système Roc1 peut être considéré comme un interrupteur décidant du mode d infection associé à P. aeruginosa. Le système Roc1 est constitué d un senseur non-orthodoxe (RocS1) et de deux régulateurs de réponse, RocA1 et RocR, dont le domaine effecteur est un domaine de liaison à l ADN ou un domaine EAL à activité phosphodiesterase, respectivement. Il existe également d autres gènes paralogues de Roc1 qui sont le système Roc2 avec RocS2 et RocA2 très similaire à RocS1 et RocA1, ainsi que RocS3 similaire à RocS1. Le travail réalisé au cours de ma thèse a montré qu il existe une régulation croisée entre Roc1 etRoc2. Cependant, chacune des branches du réseau de régulation contrôle l expression d une série de gènes bien spécifiques. Nous avons montré que la signalisation via RocS2 et RocS1 lorsqu elle converge sur RocA1 contrôle l expression des gènes cupC et ce contrôle est totalement indépendantde RocA2. Par contre lorsque la signalisation RocS1 et RocS2 converge vers RocA2 alors ce sont les gènes mexAB-oprM, qui codent une pompe d efflux impliquée dans la résistance aux antibiotiques, dont l expression est alors réprimée.En conclusion, nous avons mis en évidence un modèle unique de régulation croisée qui résulte dans un effet antagoniste entre formation du biofilm et résistance aux antibiotiques. Si cela peut paraître inattendu, quelques données cliniques sont en faveur d une telle balance. En effet, l analyse de souches de P. aeruginosa, isolées à partir de patients atteints de mucoviscidose, révèle que dans ces isolats la pompe MexAB-OprM est inactive. La raison de cette adaptation n est pas élucidée, mais l absence de pompe fonctionnelle pourrait procurer un avantage, une meilleure aptitude à la souche à persister dans cet environnement. Il est également reconnu que dans les poumons de ces patients le mode préféré de développement pour P. aeruginosa est le biofilm. Mises bout à bout ces observations suggèrent donc que le système Roc pourrait être un système de régulation important pour percevoir l environnement du poumon chez le patient mucoviscidosique et déclencher une réponse adaptée.The opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa is responsible for diverse chronic and acute infections in human. Chronic infections are associated with the capacity of P. aeruginosa to form biofilms. One of the pathways controlling biofilm formation is the Roc1 two-component system, involved in the regulation of cup genes allow the assembly of thin fimbriae at the surface of the bacterium. Cup fimbiae are important in biofilm formation. There exist paralogues of the Roc1 system - the Roc2 and Roc3 system. The work in this thesis has shown that cross-regulation occurs between Roc1 and Roc2. However, each branch in this network appears to control the expression of a specific subset of genes whose role and functions are striking in the context of an infection process. We characterized here a unique model of cross-regulation which results in the antagonistic regulation of biofilm formation and antibiotic resistanceAIX-MARSEILLE2-Bib.electronique (130559901) / SudocSudocFranceF

The Hybrid Histidine Kinase LadS Forms a Multicomponent Signal Transduction System with the GacS/GacA Two-Component System in Pseudomonas aeruginosa.

International audienceIn response to environmental changes, Pseudomonas aeruginosa is able to switch from a planktonic (free swimming) to a sessile (biofilm) lifestyle. The two-component system (TCS) GacS/GacA activates the production of two small non-coding RNAs, RsmY and RsmZ, but four histidine kinases (HKs), RetS, GacS, LadS and PA1611, are instrumental in this process. RetS hybrid HK blocks GacS unorthodox HK autophosphorylation through the formation of a heterodimer. PA1611 hybrid HK, which is structurally related to GacS, interacts with RetS in P. aeruginosa in a very similar manner to GacS. LadS hybrid HK phenotypically antagonizes the function of RetS by a mechanism that has never been investigated. The four sensors are found in most Pseudomonas species but their characteristics and mode of signaling may differ from one species to another. Here, we demonstrated in P. aeruginosa that LadS controls both rsmY and rsmZ gene expression and that this regulation occurs through the GacS/GacA TCS. We additionally evidenced that in contrast to RetS, LadS signals through GacS/GacA without forming heterodimers, either with GacS or with RetS. Instead, we demonstrated that LadS is involved in a genuine phosphorelay, which requires both transmitter and receiver LadS domains. LadS signaling ultimately requires the alternative histidine-phosphotransfer domain of GacS, which is here used as an Hpt relay by the hybrid kinase. LadS HK thus forms, with the GacS/GacA TCS, a multicomponent signal transduction system with an original phosphorelay cascade, i.e. H1LadS→D1LadS→H2GacS→D2GacA. This highlights an original strategy in which a unique output, i.e. the modulation of sRNA levels, is controlled by a complex multi-sensing network to fine-tune an adapted biofilm and virulence response

H1 and D1 domain involvement of the LadS hybrid HK in the LadS signaling pathway.

<p>(A) The pBBR<i>ladSH1D1</i> plasmid containing the <i>ladSH1D1</i> cytoplasmic DNA region of the LadS hybrid HK fused to a C-terminal His-tag, the pBBR<i>ladSH1</i>_<i>H→Q</i><i>D1</i> and pBBR<i>ladSH1D1</i>_<i>D→A</i> variant plasmids and the pBBRMCS4 corresponding empty cloning vector were conjugated in the PAK strain. Production of the corresponding cytoplasmic versions of LadS was checked in whole cell extracts using western blot and a monoclonal anti-His antibody. Numbers on the left side are molecular weight standards (kDa) (upper panel). Activity of the <i>rsmY–lacZ</i> (blue bars) and <i>rsmY–lacZ</i> (brick-red-colored bars) transcriptional chromosomal fusions were monitored after 6 hours of growth (OD_600nm≈4) and corresponding β-galactosidase activities are expressed in Miller units and correspond to mean values (with error bars) obtained from three independent experiments. Wilcoxon-Mann-Whitney tests were performed and *, **, *** and ns referred to p<0.05, p<0.01 and p<0.001 and nonsignificant difference, respectively (middle panel). Production of the H1-T6SS VgrG1 protein was detected in whole cell extracts using western blot with an anti-VgrG1 polyclonal antibody. Numbers on the left side are molecular weight standards (kDa) (lower panel). (B) Biofilm production in glass tubes of PAK, PAKΔ<i>ladS</i> and of point chromosomal mutants PAK<i>ladSH1</i>_<i>H→Q</i><i>D1</i> and PAK<i>ladSH1D1</i>_<i>D→A</i> was presented (upper panel) and quantified after crystal violet-staining and extraction (lower panel). Corresponding levels of biofilm production represented by mean values and standard deviations were obtained from three independent experiments. Wilcoxon-Mann-Whitney tests were performed and *, **, *** and ns referred to p<0.05, p<0.01 and p<0.001 and nonsignificant difference, respectively. (C) Transcript levels of RsmY (blue bars), RsmZ (brick-red-colored bars), VgrG1b (T6SS) (green bars) and ExoS (T3SS) (royal blue bars) were monitored in PAK, PAKΔ<i>ladS</i> and in point chromosomal mutants PAK<i>ladSH1</i>_<i>H→Q</i><i>D1</i> and PAK<i>ladSH1D1</i>_<i>D→A</i> strains using RT-qPCR. Fold induction was presented for the three mutant strains as compared to the PAK strain. Moderated t-tests were performed; *, ** and *** referred respectively to p<0.05, p<0.01 and p<0.001. (D) Activity of the <i>pelA–lacZ</i> (violet bars) transcriptional chromosomal fusion was monitored after 6 hours of growth (OD_600nm≈5) and corresponding β-galactosidase activities are expressed in Miller units and correspond to mean values (with error bars) obtained from three independent experiments. Statistical tests were performed and ** referred to p<0.01.</p

The GacSA-RetS-PA1611-LadS signaling network.

<p>(A) Current model for the regulatory elements influencing the expression of two sRNAs, RsmY and RsmZ. See text for details. (B) The multicomponent signal transduction system made of the LadS hybrid HK and the GacS/GacA TCS. In the presented model sustained by results obtained in the present study, this multicomponent signal transduction system made of the LadS hybrid HK and the GacS/GacA TCS forms a multiple-input system probably reflecting the variability of environmental conditions <i>P</i>. <i>aeruginosa</i> is faced with and may result in a range of gradations of chronic infection. IM (Inner Membrane), P (Periplasm), C (Cytoplasm).</p

Strains used in this study.

<p>Strains used in this study.</p

Plasmids used in this study.

<p>Plasmids used in this study.</p

Biofilm production, Pel EPS expression, H1-T6SS production and T3SS expression in the LadS signaling pathway.

<p>The pBBR<i>ladS</i> plasmid containing the <i>ladS</i> HK gene (dark bars) and the pBBRMCS4 corresponding empty cloning vector (light bars) were conjugated in the PAK, PAKΔrsmY, PAKΔ<i>rsmZ</i> or PAKΔ<i>rsmY</i>Δ<i>rsmZ</i> strains. (A) Biofilm production in glass tubes was illustrated (upper panel) and quantified after Crystal Violet-staining (lower panel). Corresponding levels of biofilm production represent mean values and standard deviations obtained from three independent experiments. (B) Activity of the <i>pelA–lacZ</i> transcriptional chromosomal fusion was monitored in the same strains with the pBBR<i>ladS</i> plasmid containing the <i>ladS</i> HK gene (dark violet bars) and the pBBRMCS4 corresponding empty cloning vector (light violet bars) after 4 hours of growth (OD_600nm≈3.5). Corresponding β-galactosidase activities are expressed in Miller units and correspond to mean values (with error bars) obtained from three independent experiments. (C) Production of the H1-T6SS VgrG1s proteins was detected in whole cell extracts using western blot with an anti-VgrG1 polyclonal antibody. Numbers on the left side correspond to molecular weight standards (kDa). (D) Activity of the <i>exoS–lacZ</i> transcriptional chromosomal fusion was monitored in the same strains with the pBBR<i>ladS</i> plasmid containing the <i>ladS</i> HK gene (dark royal blue bars) and the pBBRMCS4 corresponding empty cloning vector (light royal blue bars) after 6 hours of growth (OD_600nm≈4). Corresponding β-galactosidase activities are expressed in Miller units and correspond to mean values (with error bars) obtained from three independent experiments. Wilcoxon-Mann-Whitney tests were performed and *, **, *** and ns referred to p<0.05, p<0.01 and p<0.001 and nonsignificant difference, respectively.</p

Involvement of the H2 domain of the GacS unorthodox HK in the LadS signaling pathway.

<p>The pBBR<i>ladS</i> plasmid containing the <i>ladS</i> HK gene and the pBBRMCS4 corresponding empty cloning vector were conjugated in the PAKΔ<i>gacS</i> strain in which the <i>gacSH2</i> or <i>gacSH2</i>_<i>H→Q</i> gene versions or the corresponding suicide vector were chromosomally integrated at the Tn7 site. (A) RsmY (blue bars) and RsmZ (brick-red-colored bars) transcript levels were monitored using RT-qPCR and fold induction was presented in the strains PAKΔ<i>gacS</i>::<i>miniTn7gacSH2</i> (<i>gacSH2</i>) and PAKΔ<i>gacS</i>::<i>miniTn7gacSH2</i>_<i>H→Q</i> (<i>gacSH2</i>_<i>H→Q</i>) as compared to the PAKΔ<i>gacS</i>::<i>miniTn7</i> strain (<i>miniTn7</i>). (B) Biofilm production in glass tubes was illustrated (upper panel) and quantified after crystal violet-staining (lower panel). Corresponding levels of biofilm production represent mean values and standard deviations obtained from three independent experiments. Wilcoxon-Mann-Whitney tests were performed; ** and ns referred to p<0.01 and nonsignificant difference. <b>C.</b> PelA (violet bars) and ExoS (royal blue bars) transcript levels were monitored using RT-qPCR and fold induction was presented in the strains PAKΔ<i>gacS</i>::<i>miniTn7gacSH2</i> (<i>gacSH2</i>) and PAKΔ<i>gacS</i>::<i>miniTn7gacSH2H→Q</i> (<i>gacSH2H→Q</i>) as compared to the PAKΔ<i>gacS</i>::<i>miniTn7</i> strain (<i>miniTn7</i>). (D) Production of the H1-T6SS Hcp1 proteins was detected in whole cell extracts using western blot with an anti-Hcp1 polyclonal antibody. Numbers on the left side are molecular weight standards (kDa). Moderated t-tests were performed and *, **, *** and ns referred to p<0.05, p<0.01 and p<0.001 and nonsignificant difference, respectively. (E) Transcript levels of RsmY (blue bars), RsmZ (brick-red-colored bars), VgrG1 (green bars), PelA (violet bars) and ExoS (royal blue bars) were monitored using RT-qPCR. Fold induction was presented in the strains PAK, PAKΔ<i>ladS</i>, PAK<i>gacSH1</i>_<i>H→Q</i>, PAK<i>gacSH1</i>_<i>H→Q</i>Δ<i>ladS</i>, PAK<i>gacSH1</i>_<i>H</i>→_<i>Q</i><i>H2</i>_<i>H</i>→_<i>Q</i> and PAK<i>gacSH1</i>_<i>H</i>→_<i>Q</i><i>H2</i>_<i>H</i>→_<i>Q</i>Δ<i>ladS</i> in order to disable autophosphorylation of the GacSH1 domain and the functionality of the GacsH2 domain, respectively. Moderated t-tests were performed and *, **, *** and ns referred to p<0.05, p<0.01 and p<0.001 and nonsignificant difference, respectively.</p

<i>In vitro</i> transphosphorylation assays.

<p>(A) For transphosphorylation assay between LadS or GacS variants and GacSH2 variants or HptA protein, 2 mM of LadSH1D1 or LadSH1D1_D→A recombinant proteins were incubated with [γ-³²P] ATP and GacSH2 (lanes 1 and 2), GacSH2_H→Q (lanes 3 and 4) or HptA (lanes 5 and 6) at room temperature for 20 min (see <a href="http://www.plosgenetics.org/article/info:doi/10.1371/journal.pgen.1006032#sec010" target="_blank">Materials and Methods</a>) then separated in an SDS-polyacrylamide gel in duplicate. (B) Transphosphorylation assay between the LadSH1D1_D→A or GacSH1 and LadSD1 or GacsD1 domains with or without the GacSH2 domain. Two mM of LadSD1 or GacSD1 recombinant proteins were incubated with [γ-³²P] ATP and LadSH1D1_D→A or GacSH1 (left panel<b>)</b> together with the GacSH2 domain (right panel) at room temperature for 20 min. In both experiments mixtures of proteins were separated in an SDS-polyacrylamide gel in duplicate. Numbers on the left side are molecular weight standards (kDa). Locations of the recombinant proteins are indicated by arrowheads. For each experiment presented in panels A and B, one gel was detected by western blot using an anti-penta-His antibody (upper panel) while the other was autoradiographied (lower panel).</p