Laboratory diagnosis of rabies by the fluorescent antibody test applied to brain tissues of experimentally inoculated mice and either preserved in formalin or under refrigeration

Avaliou-se a adequação do emprego de cérebros preservados em formol para o estabelecimento rápido do diagnóstico da raiva pela reação de imunofluorescência direta, utilizando a técnica de digestão enzimática de pepsina e tripsina e método de impressão para o preparo de lâminas. O delineamento proposto contou com fragmentos de cérebros de camundongos experimentalmente infectados submetidos a diferentes tratamentos de conservação, com o uso de soluções de formol com pH corrigidos, ou submetidos à refrigeração; os testes de imunofluorescência foram realizados em 10 fases experimentais, por um período de 28 dias. Os resultados da prova de imunofluorescência variaram de 58.0% a 90.0% de positividade, dependendo dos tratamentos dispensados. Nas condições do experimento, os materiais destinados à prova de imunofluorescência podem ser conservados em temperatura de refrigeração por até 96 horas; após este período aumentam os resultados irregulares devido à degradação tissular. Nos tecidos mantidos em formol e após digestão enzimática, com a aplicação do método de impressão, observou-se o fenômeno de restauração da antigenicidade do vírus rábico, permitindo uma adequada identificação através da prova de imunofluorescência; no entanto, estes procedimentos não devem substituir os métodos atualmente empregados para o diagnóstico rápido da raiva.The fitness of formalin - treated materials for use in rapid rabies diagnosis was evaluated through Fluorescent Antibody (FA) test, using the digestion technique of pepsin and trypsin and the impression method of slide preparation. To achievc this proposal, brain fragments of experimentally rabid mice were submitted to different treatments of brain preservation by either using. pH adjusted formalin solutions or refrigeration, and the FA tests were run at ten experimental phases for a test period of 28 days. The results of FA reactivity ranged from 90.0% to 58.0%, depending on the treatments submitted; under the condition of the experiment, brain specimens should be maintained at refrigerating temperature until 96 hours for suitable FA examination, over this period the results should be irregular due to tissue degradation. The preservation of brain fragments in formalin, with further enzymatic digestion of pepsin and trypsin and the use of impression method did not mask or alter the virus antigenicity for adequate identification through FA technique, although the procedures should never substitute the existing methods of rapid rabies diagnosis

Influência do tratamento com hormônio corticosteróide sobre a sensibilidade do cão à infecção experimental, via intramuscular, com vúus rábico de “rua”

Sixteen dogs (1 -2 years old and 8 -1 0 kg) were used. Nine of them were individually treated with 25 milligrams/day of hydrocortison acetate through the subcutaneous route three days before and on the day of rabies virus inoculation. Seven dogs were used as controls being not treated with hormone. Results showed that eight animals presented signs of rabies and died from 13 to 23 days after challenge, all of them were positive for rabies tested by the immunofluorescence and mouse inoculation tests; only one of these dogs belonged to the control group. The remaining eight animals without signs of the disease (six of them not treated with hormone), were sacrificed from 38 to 88 days after the virus challenge being observed that they were negative for the same rabies laboratory tests described above. Thus the number of dogs positive for rabies was significantly higher in animals treated with corticosteroid hormone.De 16 cães adultos experimentalmente infectados com o vírus rábico de “rua”, via intramuscular, nove receberam hormônio corticosteróide e sete constituíram o grupo controle, sem tratamento hormonal. A dosificação de hormônio consistiu da aplicação diária de 25 miligramas de acetato de delta hidrocortisona em suspensão, via subcutânea, por animal, nos três dias que antecederam e por ocasião da inoculação do vírus. Após um período de observação variável entre 13 e 23 dias da inoculação do vírus, sete dos nove animais do grupo que recebeu hormônio sucumbiram em consequência da raiva, a qual foi confirmada através dás provas de imunofluorescência direta e de inoculação intracerebral em camundongos, enquanto que apenas um dos sete animais do grupo controle, manifestou a doença. Decorrido um período de observação variável entre 38 e 88 dias após a inoculação virai, os oito animais remanescentes, dois dos quais tratados com corticosteróide e seis do grupo controle, não apresentaram sinais da raiva e foram sacrificados, mostrando-se negativos nos exames laboratoriais para diagnóstico da raiva, realizados após o sacrifício. A análise estatística dos resultados obtidos revelou que o número de animais mortos em consequência da raiva, durante os períodos de observação adotados, foi Significativamente maior para o grupo que recebeu hormônio (p < 0,05)

Estabilidade do conjugado anti-rábico para reação de imunofluorescência direta pré-diluído e armazenado em freezer comum

A estabilidade do conjugado antirrá-bico para reação de Imunofluorescência Direta, preparado a partir de imunoglobulina de hamsters e pré-diluido com suspensões de cérebros de camundongos normais e camundongos infectados com vírus CVS (Challenge Virus Standard) foi investigada, utilizando-se a glicerina 50% como preservativo adicional. O conjugado pré-diluído, com e sem glicerina, foi dispensado em alíquotas de 0,5 ml e armazenado a -20°C. As reações de Imunofluorescência Direta foram realizadas em intervalo de cada 3 meses e após 2 anos, os resultados obtidos foram satisfatórios; no entanto, a adição de glicerina não revelou nenhuma diferença substancial na fluorescência e nem quanta ao tempo de armazenamento do conjugado pré-diluído.The stability of fluorescein-conjugated hamster's antirabies globulin premixed to normal and rabid mouse brain suspensions was investigated, using the 50% glycerin as an additional preservative. The premixed conjugate, with and whithout addition of glycerin was dispensed in 0.5 ml aliquots and stored at -20° C. The tests were run each 3 month interval and after 2 years the results were quite satisfactory, although the addition of glycerin did not reveal any substantial difference to the fluorescence of the known rabies smears and to the storage life of the premixed conjugate

Demonstração da presença de antigeno rábico nas glândulas salivares submaxilares e parótidas de cães naturalmente infectados. Emprego da reação de imunofluorescência direta em impressões de tecido glandular semimacerado

Submaxillary and parotid glands of 30 naturally rabies infected dogs were examined using the direct fluorescent antibody (FA) technique on tissue smears of semi-ground salivary glands. Mouse inoculation (MI) tests of all examined salivary glands were run in parallel and the rabies diagnosis was confirmed by means of FA and MI tests of materials taken from the Ammon's horn. Specimens taken from the submaxilar glands and Ammon's horn were 100.0% positive for FA and MI tests, however, for the specimens taken from the parotid glands it was found one negative result with both FA and MI test and 11 discrepancies: five FA negative – MI positive results and six FA positive – MI negative results. The results found in this experiment demonstrated the practicality of the FA test using smears of semi-ground salivary glands. This technique should become an alternative tool for the study of rabies pathogenesis, especially for the search of the rabies virus associated with the organs involved in the virus transmission.As glândulas salivares submaxilares e parótidas de 30 cães, naturalmente infectados pelo vlrus da raiva, foram examinadas mediante a reação de imunofluorescência direta (IFD), aplicada a raiva em impressões obtidas do tecido glandular semi-macerado. Os controles adotados foram o exame de tais glândulas através da técnica de inoculação intracerabral em camundongos (IIC) e a pesquisa da presença do vírus rábico no corno de Ammon dos respectivos animais, segundo as técnicas de IFD e de IIC. As glândulas salivares submaxilares e o corno de Ammon foram positivos em todas as oportunidades para as técnicas de IFD e IIC. As glândulas salivares parátidas revelaram um resultado negativo frente às duas técnicas referidas e 11 resultados discordantes, dos quais cinco IFD negativa – IIC positiva e seis IFD positiva - IIC negativa. Os valores observados demonstraram um bom comportamento para o exame das glândulas salivares submaxilares pela IFD aplicada à raiva em impressõe s do tecido glandular semi-macerado. Esta metodologia oferece um novo instrumento para o estudo da patogenia da raiva, particularmente em investigações que procurem esclarecer apresença do vírus ao nivel dos órgãos envolvidos com a sua transmissão

Perfil da resposta imune humoral de bovinos após a revacinação com vacina anti-rábica inativada, preparada em células BHK contendo Hidróxido de Alumínio

The phenomenon of "in vivo" blocking effect of antigen, due to the presence of rabies specific neutralizing antibodies in previously vaccinated cattle, and its possible interference on the humoral immunologic response to revaccination was investigated in five zebu-crossbred bovines reared in field condition. The secondary vaccination was performed 180 days from the first immunization, using a commercial inactivated rabies vaccine prepared in BHK-21 cells. Serum samples were taken sequentially after each vaccine administration at intervals of 0 (zero), 24 and 72 hours, and after 7 and 14 days for the determination of neutralizing antibodies. The mean neutralizing antibody titer determined for sera taken immediately before the first vaccination was < 1:5, at 24 and 72 hours post-vaccination, < 1:6.25; the mean value found at 7 days post-vaccination was 1:144 ± 51;and 1:3,460 ± 1,329, at 14 days post-vaccination with mean titer of 1:58 ± 14; 24 hours after revaccination the mean titer was 1:129 ± 80, raising forwardly to1:277 ± 161, at 72 hours post-revaccination, and increasing levels > 1:6,400 and > 1:25,600 were found at 7 and 14 days post-revaccination, evidenciating a full anamnestic response. The blocking effect of antigen and the consequent fall in antibody levels shortly after the revaccination was not observed.O fenômeno do consumo de antígeno, devido apresentação de anticorpos neutralizantes específicos para a raiva, em bovinos previamente vacinados e a sua possível interferência na resposta imunológica humoral, decorrente de revacinação, foi investigado em cinco bovinos mestiços azebuados, criados em condições de campo. A revacinação foi realizada 180 dias após a primeira aplicação, utilizando uma vacina comercial inativada, preparada em células BHK-21. As amostras de soros foram obtidas em intervalos sequenciais de 0 (zero), 24 , 72 horas, sete e 14 dias, em cada vacinação e foram submetidas à prova de neutralização em camundongos para a pesquisa de anticorpos. O título médio de anticorpos neutralizantes, encontrado para o momento imediatamente antes da primeira vacinação foi < 1:5, 24 e 72 horas após a vacinação foi < 1:6, 25; no sétimo dia pós-vacinação o valor médio foi de 1:144 ± 51; aos 14 dias pós-vacinação, 1:3.460 ± 1.329. Todos os animais apresentaram títulos detectáveis no 180ª dia pós-vacinação, com um valor médio de 1:58 ± 14; no entanto, 24 horas após a dose revacinante, foi detectado um valor médio de 1:129 ± 80, ascendendo para 1:277 ± 161 no 3 S dia pós-vacinação, e níveis crescentes no 7 ! e no 14! pós-vacinação, com valores, respectivamente, superiores a 1:6.400 e1:25.600, indicando o estabelecimento de uma resposta anamnéstica plena. Não foi observado o efeito do consumo do antígeno e a consequente diminuição nos títulos de anticorpos, imediatamente após a revacinação

Reações sorológicas para Brucella canis em cães errantes capturados na proximidade dos parques públicos, reservas florestais e em áreas periféricas do municipio de São Paulo - Brasil

A total of 254 (7.5%) sera from 3386 stray dogs captured between the period of 1981 and 1985, through the reservoir control programme established by the Centro de Controle de Zoonoses, Secretaria de Higiene e Saúde do Municipio de São Paulo - SP, Brazil, coming from 14 localities of Northern, Southern, Eastern, and Western areas of the city were found to be positive for Brucella canis antibodies by means of agar-gel precipitation test. Statistically significant differences were rot found among the number of reactors captured at different localities included in this survey. In view of the reactant animals for B. canis shown to be present among the stray dogs coming from four large divisions of the city, and due to the threat of this potential zoonotic agent, there is a need to strengthen the control measures of urban zoonosis, especially in the huge metropolitan area of São Paulo City.De 3386 cães errantes capturados pelo programa de controle de reservatórios de zoonoses do Centro de Controle de Zoonoses da Secretaria de Higiene e Saúde do município de São Paulo, durante o período de 1981 a 1985, em 14 localidades, distribuídas pelas quatro divisões regionais da cidade. (Norte, Sul, Leste e Oeste), 254 foram reagentes positivos na prova de difusão em gel de ágar para a demonstração de anticorpos precipitantes para Brucella canis. Ao nível de significância de 0,05 não houve diferença estatística entre as taxas de animais reagentes, encontradas nas diversas localidades estudadas. A existência de reservatórios de B. canis, nas quatro grandes divisões do município de São Paulo, ressalta a importância, em saúde pública, dos serviços de controle de zoonoses urbanas nesta extensa área metropolitana

Emprego da glicerina como elemento auxiliar na conservação do vírus da febre aftosa

Two fractions of the same Type “C” Waldmann, subtype“C3” Indaial foot-and-mouth disease (FMD) virus suspension were added respectively to equal volume of glycerine and an ordinary diluent (Earle’s saline containing 2,000 UI of penicillin G and 2,0 miligrams of stretomyc in per mililiter), and stored at -20°C. The results obtained at 117, 150, 185 and 213 days after their preparation by means of replicated consecutive titration test using suckling mice, showed higher stability for the glycerine-added suspension.Duas porções de uma mesma suspensão de vírus, tipo ‘C’ Waldmann, Subtipo ‘C3’ Indaial, da febre aftosa foram adicionadas a igual volume, respectivamente de glicerina e de diluente comum (Salina de Earle adicionada de 2.000 UI de penicilina G potássica e 2,0 miligramas de sulfato de estreptomicina por mililitro), e estocada a -20°C. Os resultados obtidos nas provas de Titulação sucessivas realizadas, em camundongos lactentes, imediatamente após e aos 117, 150, 185 e 213 dias de sua preparação revelam uma maior estabilidade da suspensão adicionada de glicerina

Characterization of Novel OmpA-Like Protein of Leptospira interrogans That Binds Extracellular Matrix Molecules and Plasminogen

Leptospira interrogans is the etiological agent of leptospirosis, a zoonotic disease of human and veterinary concern. The identification of novel proteins that mediate host-pathogen interactions is important for understanding the bacterial pathogenesis as well as to identify protective antigens that would help fight the disease. We describe in this work the cloning, expression, purification and characterization of three predicted leptospiral membrane proteins, LIC10258, LIC12880 (Lp30) and LIC12238. We have employed Escherichia coli BL21 (SI) strain as a host expression system. Recently, we have identified LIC12238 as a plasminogen (PLG)-binding receptor. We show now that Lp30 and rLIC10258 are also PLG-receptors of Leptospira, both exhibiting dose-dependent and saturating binding (KD, 68.8±25.2 nM and 167.39±60.1 nM, for rLIC10258 and rLIC12880, respectively). In addition, LIC10258, which is a novel OmpA-like protein, binds laminin and plasma fibronectin ECM molecules and hence, it was named Lsa66 (Leptospiral surface adhesin of 66 kDa). Binding of Lsa66 to ECM components was determined to be specific, dose-dependent and saturable, with a KD of 55.4±15.9 nM to laminin and of 290.8±11.8 nM to plasma fibronectin. Binding of the recombinant proteins to PLG or ECM components was assessed by using antibodies against each of the recombinant proteins obtained in mice and confirmed by monoclonal anti-polyhistidine antibodies. Lsa66 caused partial inhibition on leptospiral adherence to immobilized ECM and PLG. Moreover, this adhesin and rLIC12238 are recognized by antibodies in serum samples of confirmed leptospirosis cases. Thus, Lsa66 is a novel OmpA-like protein with dual activity that may promote the attachment of Leptospira to host tissues and may contribute to the leptospiral invasion. To our knowledge, this is the first leptospiral protein with ECM and PLG binding properties reported to date

Exposure of free-ranging wild carnivores, horses and domestic dogs to Leptospira spp in the northern Pantanal, Brazil

Leptospirosis is a zoonotic disease affecting most mammals and is distributed throughout the world. Several species of domestic and wild animals may act as reservoirs for this disease. The purpose of this study was to assess the exposure of free-ranging wild carnivores, horses and domestic dogs on a private reserve located in the northern Pantanal (Brazil) and the surrounding areas to Leptospira spp from 2002-2006, 75 free-ranging wild carnivores were captured in the Pantanal and serum samples were collected. In addition, samples from 103 domestic dogs and 23 horses in the region were collected. Serum samples were tested for the presence of Leptospira antibodies using the microscopic agglutination test. Thirty-two wild carnivores (42.7%) were considered positive with titres > 100, and 18 domestic dogs (17.5%) and 20 horses (74.1%) were also found to be positive. Our study showed that horses, dogs and several species of free-ranging wild carnivores have been exposed to Leptospira spp in the Pantanal, suggesting that the peculiar characteristics of this biome, such as high temperatures and an extended period of flooding, may favour bacterial persistence and transmission. In this region, wild carnivores and horses seem to be important hosts for the epidemiology of Leptospira species.CNPqSES

Investigação epidemiológica sobre as zoonoses de maior constatação em matadouros. I. Suínos

The analysis of post-mortem examination data of 194.361 swine carcasses, proceeding from 306 swine breeding municipalities of eight Brazilian states and that had been slaughtered and processed by slaughter houses placed in the state of São Paulo (Brazil), provided the following information: 1. The tuberculosis, cysticercosis and hydatidosis were the diseases of most frequent ocurrence. 2. The wide scattering of these zoonoses in those states considered in this study was confirmed by the presence of cysticercosis in carcasses of pigs proceeding from all eight states, tuberculosis in pigs of seven, and hydatidosis, in swines of 5 states. The distribution of these diseases according to the 306 municipalities traced in this study, was as follows: the tuberculosis occurred in 128 the cysticercosis in 62, and hydatidosis in 45 municipalities, and in 129 municipalities there was no registration of any of these three diseases in their herds, 132 municipalities registered only one disease, while 32 with two, and 13 municipalities were concurrent to the three diseases. 3. The information collected by the meat inspection service, concerned to the detection of pathologic lesions, especially those related to zoonoses, can provide valuable contribution in guiding and choosing the priorities for the adoption of sanitary measures by the Public Health and the Animal Health Authorities.O exame post-mortem realizado, ao nível de matadouro, em 194.361 carcaças de suínos procedentes de 306 municípios pertencentes a oito estados brasileiros, revelou o seguinte: 1. As patologias de maior ocorrência registradas foram representadas pela tuberculose, cisticercose e hidatidose. 2. A despeito da ampla dispersão destas zoonoses nos territórios considerados, revelada pela presença da cisticercose em todos os oito estados trabalhados; da tuberculose em sete e da hidatidose em cinco deles, a distribuição das mesmas, nos 306 municípios que concorreram para o presente estudo, mostrou um quadro deveras interessante do ponto de vista da vigilância epidemiológica: a tuberculose foi registrada em 128 municípios, a cisticercose em 62 e a hidatidose em 45 deles, mostrando, ainda, que 129 dos municípios não revelaram presença das três doenças em seus rebanhos suínos; 132 acusaram apenas uma das patologias consideradas; 32 revelaram duas delas e em apenas 13 foram encontradas as três doenças. 3. As informações registradas pelo Serviço de Inspeção Federal, relativas às lesões das doenças dos animais e, em particular, das zoonoses, podem oferecer valiosos subsídios para a orientação da escolha de prioridades para a adoção de medidas sanitárias por parte dos organismos responsáveis pela Saúde Animal e Saúde Pública