Engineered Sortases in Peptide and Protein Chemistry

The transpeptidase sortase A of Staphylococcus aureus (Sa-SrtA) is a valuable tool in protein chemistry. The native enzyme anchors surface proteins containing a highly conserved LPxTG sorting motif to a terminal glycine residue of the peptidoglycan layer in Gram-positive bacteria. This reaction is exploited for sortase-mediated ligation (SML), allowing the site-specific linkage of synthetic peptides and recombinant proteins by a native peptide bond. However, the moderate catalytic efficiency and specificity of Sa-SrtA fueled the development of new biocatalysts for SML, including the screening of sortase A variants form microorganisms other than S. aureus and the directed protein evolution of the Sa-SrtA enzyme itself. Novel display platforms and screening formats were developed to isolate sortases with altered properties from mutant libraries. This yielded sortases with strongly enhanced catalytic activity and enzymes recognizing new sorting motifs as substrates. This minireview focuses on recent advances in the field of directed sortase evolution and applications of these tailor-made enzymes in biochemistry

Entwicklungsverläufe und Karrieremuster im internationalen Spitzentennis. Zum Problem des Übergangs vom Junioren- in den Profibereich

Das Erkenntnisinteresse der vorliegenden Studie richtet sich domänenspezifisch auf die Gene-se von Expertise in der Sportart Tennis. Die Beobachtung außergewöhnlicher, individueller Leistungen – sei es in der Musik, in der Mathematik oder im Sport – weckt unweigerlich den (Forscher-)Drang, ihr Zustandekommen beschreiben, verstehen, vielleicht sogar erklären zu können. Insbesondere für diejenigen, welche mit der Förderung hochleistungsorientierter Tennistalente betraut werden, ist es von großem Wert, wenn empirisches Wissen darüber vor-liegt, wie sich die Entwicklung von heutigen Spitzenathleten – von der Kindheit bis zum Kar-rierehöhepunkt – vollzogen hat. Innerhalb des Karriereverlaufs wiederum scheint der Über-gang vom Juniorentennis in den professionellen Erwachsenenbereich eine neuralgische Phase darzustellen, deren erfolgreiches Durchlaufen als Meilenstein auf dem Weg unter die besten 100 Spielerinnen und Spieler der Welt gehandelt wird. Die theoretische Fundierung des zu untersuchenden Gegenstandes erfolgt in erster Linie über einen Zugang, der – einem weit gefassten Terminus von „Entwicklung“ entsprechend – all-gemein Veränderungsprozesse zu berücksichtigen hat. Diese Entwicklungsperspektive richtet sich auf Veränderungen näher zu bestimmender Bereiche und Kontexte in den Lebensläufen von Tennistalenten, von spitzensportlichen Persönlichkeiten, die in der Domäne Tennis Ex-pertise (bzw. Teilexpertise) erlangt haben. Ein überwiegend personzentrierter, holistischer Ansatz zur Erklärung von Veränderungsprozessen im Lebenslauf – wie hier konzeptionalisiert – legt es nahe, entwicklungs- und sozialisationstheoretische Überlegungen anzustellen. Die empirische Bearbeitung erfolgt durch eine Kombination bzw. Integration quantitativ und qualitativ gefärbter Analyseschritte. Eine multimethodische Triangulation auf der Designebene ist angebracht, um der Komplexität des Phänomens (bzw. dem theoretischen Rahmen) gerecht zu werden respektive es problemadäquat erfassen zu können. Die Genese von Spitzenleistung im Tennis soll dem Expertiseansatz entsprechend retrospektiv, zudem per Fragebo-genmethode, anhand individueller, zeitbezogener Lebenslaufdaten sowie biographisch-subjektiver Deutungen und Muster, die wiederum in qualitativen Einzelfallstudien (problem-zentrierte, halbstandardisierte Leitfadeninterviews) zum Ausdruck kommen, nachgezeichnet werden. Dynamisch-prozessuale Charakteristiken, im konkreten Falle intraindividuelle Ent-wicklungen bzw. Veränderungen über die Zeit (Talententwicklung) der Untersuchungseinhei-ten „Tennisprofis“ erschließen sich durch rückblickende Rekonstruktionen individueller Le-bensläufe bzw. Karrieren und deren biographische Deutungen. Erfasste Themenbereiche: (1) Leistungsentwicklung/sportlicher Karriereverlauf, (2) Doppel-belastung Schule und Tennis, (3) Merkmale der (institutionellen) Förderkarriere, (4) Training und Wettkampf, (5) Trainer, Eltern/Familie, Freunde, (6) Intentionale Selbstentwick-lung/Endogene Ressourcen, (7) Psychischer Druck, spezifische Ereignisse und Belastungen. Die Befunde bestätigen u.a. die Grundannahme der Expertiseforschung, wonach den perso-nexternen Einflussfaktoren im Karriereverlauf eine hohe Bedeutung zukommt, im Tennis in-sbesondere den finanziellen Ressourcen und der elterlichen Unterstützung. Desweiteren wur-de mittels Clusteranalyse die Gruppe der Athleten mit höchstem Schulabschluss und hoher Dynamik der Leistungsentwicklung beim Einstieg in die Profitour als förderbiographisch am stärksten vernachlässigte markiert. Geeignete Maßnahmen seitens institutioneller Förderein-richtungen, etwa die Betreuung der Talente über das 18.Lebensjahr hinaus, sind indiziert, um weitere Potentiale freizusetzen

Quantitative Assessment of Protein Interaction with Methyl-Lysine Analogues by Hybrid Computational and Experimental Approaches

ABSTRACT: In cases where binding ligands of proteins are not easily available, structural analogues are often used. For example, in the analysis of proteins recognizing different methyl-lysine residues in histones, methyl-lysine analogues based on methyl-amino-alkylated cysteine residues have been introduced. Whether these are close enough to justify quantitative interpretation of binding experiments is however questionable. To systematically address this issue, we developed, applied, and assessed a hybrid computational/experimental approach that extracts the binding free energy difference between the native ligand (methyl-lysine) and the analogue (methyl-amino-alkylated cysteine) from a thermodynamic cycle. Our results indicate that measured and calculated binding differences are in very good agreement and therefore allow the correction of measured affinities of the analogues. We suggest that quantitative binding parameters for defined ligands in general can be derived by this method with remarkable accuracy. Fine-tuned regulation of gene expression in eukaryotic cellsrelies on packaging of DNA into different chromatin contexts.1 The repetitive unit of chromatin, the nucleosome, is formed by wrapping short stretches of DNA around

Photoinduced host-to-guest electron transfer in a self-assembled coordination cage

A [Pd2L4] coordination cage, assembled from electron-rich phenothiazine-based ligands and encapsulating an electron-deficient anthraquinone-based disulfonate guest, is reported. Upon excitation at 400 nm, transient absorption spectroscopy unveils photoinduced electron transfer from the host's chromophores to the guest, as indicated by characteristic spectral features assigned to the oxidized donor and reduced acceptor. The structure of the host–guest complex was characterized by NMR spectroscopy, mass spectrometry and single-crystal X-ray analysis. Spectroelectrochemical experiments and DFT calculations both agree with the proposed light-induced charge separation. A kinetic analysis of the involved charge transfer channels reveals, besides a guest-independent LMCT path, 44% efficiency for the host–guest charge transfer (HGCT)

Sortase-Mediated Multi-Fragment Assemblies by Ligation Site Switching

Sortase-mediated ligation (SML) is a powerful tool of protein chemistry allowing the ligation of peptides containing LPxTG sorting motifs and N-terminal glycine nucleophiles. The installation of a sorting motif into the product prohibits the assembly of multiple fragments by SML. Here we report multi-fragment SML based on switchable sortase substrates. Substitution of the Leu residue by disulfide-containing Cys(StBu) results in active sorting motifs, which are inactivatable by reduction. In combination with a photo-protected N-Gly nucleophile, multi-fragment SML is enabled by repetitive cycles of SML and ligation site switching. The feasibility of this approach was demonstrated by a proof-of-concept four-fragment ligation, the assembly of peptide probes for bivalent chromatin binding proteins and oligomerization of peptide antigens. Biochemical and immuno-assays demonstrated functionality of these probes rendering them promising tools for immunology and chromatin biochemistry

Kinetics of NH3 Desorption and Diffusion on Pt: Implications for the Ostwald Process.

We report accurate time-resolved measurements of NH3 desorption from Pt(111) and Pt(332) and use these results to determine elementary rate constants for desorption from steps, from (111) terrace sites and for diffusion on (111) terraces. Modeling the extracted rate constants with transition state theory, we find that conventional models for partition functions, which rely on uncoupled degrees of freedom (DOFs), are not able to reproduce the experimental observations. The results can be reproduced using a more sophisticated partition function, which couples DOFs that are most sensitive to NH3 translation parallel to the surface; this approach yields accurate values for the NH3 binding energy to Pt(111) (1.13 ± 0.02 eV) and the diffusion barrier (0.71 ± 0.04 eV). In addition, we determine NH3's binding energy preference for steps over terraces on Pt (0.23 ± 0.03 eV). The ratio of the diffusion barrier to desorption energy is 0.65, in violation of the so-called 12% rule. Using our derived diffusion/desorption rates, we explain why established rate models of the Ostwald process incorrectly predict low selectivity and yields of NO under typical reactor operating conditions. Our results suggest that mean-field kinetics models have limited applicability for modeling the Ostwald process.D.B. and M.S. thank the BENCh graduate school, funded by the DFG (389479699/GRK2455). I.R. gratefully acknowledges the support by Israel Science Foundation, ISF (Grant No. 2187/19), and by the Open University of Israel Research Authority (Grant No. 31044). O.G. acknowledges financial support by the Spanish Ministerio de Ciencia e Innovación (Grant No. PID2019-107396GB-I00/AEI/10.13039/501100011033). T.N.K., G.S., M.S., and J.F. acknowledge support from the European Research Council (ERC) under the European Union’s Horizon 2020 research and innovation program (Grant Agreement No. 833404)