Regulación de la homeostasis del glucógeno: el papel de R6 y la enfermedad de Lafora

El glucógeno es la principal reserva de energía en nuestras células y es una molécula esencial para nuestro cerebro. Sin embargo, muchas cuestiones sobre el complejo metabolismo de este carbohidrato siguen por elucidar. Un paso clave en la regulación de la homeostasis del glucógeno es el llevado a cabo por la proteína fosfatasa de tipo 1, PP1. PP1 es capaz de estimular la síntesis de glucógeno mediante la desfosforilación de dos enzimas clave: la glucógeno sintasa (GS) y la glucógeno fosforilasa (GP). La fosfatasa necesita unirse a subunidades reguladoras para el reconocimiento de los diferentes sustratos. En el metabolismo del glucógeno, se han descrito hasta la fecha 7 de estas subunidades reguladoras, siendo R6 una de las más ubicuas y presente mayoritariamente en músculo esquelético, corazón y cerebro. En este trabajo hemos analizado la capacidad glucogénica de R6 en células de neuroblastoma de ratón. Se han estudiado además los diferentes dominios de unión presentes en R6 y su implicación en la regulación de la síntesis de glucógeno. Se ha caracterizado el motivo de unión de R6 a PP1 (R102VRF ) así como la zona de interacción con los diferentes sustratos: GS y GP (W267DNND). La unión a estos dos dominios de interacción ocurre de manera independiente, sin embargo, la pérdida de unión en cualquiera de ellos impide la estimulación de la síntesis de glucógeno producida por R6. Asimismo, hemos definido un nuevo dominio presente en R6 implicado en la unión a las proteínas 14-3-3 (RARS74LP). Esta unión media la regulación de la capacidad glucogénica de R6 ya que, cuando se impide la unión a la subunidad reguladora, la acumulación de glucógeno producida por R6 se ve exacerbada. Además, la unión de las proteínas 14-3-3 a R6 previene su degradación lisosomal, regulando por tanto la estabilidad de la proteína. Este mecanismo de regulación novedoso añadiría un grado más de complejidad a la homeostasis del metabolismo de glucógeno, mostrando una nueva manera de señalización. En este trabajo de tesis doctoral también hemos abordado la regulación del metabolismo del glucógeno en la enfermedad de Lafora (LD. OMIM 254780) y su relación con la subunidad reguladora R6. La enfermedad de Lafora es una enfermedad neurodegenerativa autosómica recesiva que conlleva epilepsia mioclónica progresiva y presenta un desenlace fatal. Debuta durante la adolescencia con ataques generalizados tónico clónicos, mioclonias, ausencias, desvanecimientos y alucinaciones visuales. La enfermedad progresa con demencia progresiva con apraxia, afasia y pérdidas visuales que llevan a los pacientes a un estado vegetativo y a la muerte, que tiene lugar generalmente a los 10 años desde la aparición de los primeros síntomas. Una marca de la enfermedad es la acumulación intracelular de “glucógeno insoluble”, los denominados cuerpos de Lafora. Dichas inclusiones aparecen en el citoplasma de múltiples tejidos entre los que se incluyen cerebro, riñón, piel, hígado y músculo esquelético y cardiaco. La composición de los cuerpos de Lafora se asemeja a la de un glucógeno pobremente ramificado, con características similares a un poliglucosano de plantas, la amilopectina, que le confieren la falta de solubilidad y por tanto, la aparición de inclusiones. Las mutaciones que causan la enfermedad de Lafora han sido identificadas en dos genes EPM2A y EPM2B, aunque hay evidencias de un tercer locus. EPM2A codifica para una fosfatasa dual, la laforina, con un dominio de unión a carbohidratos en la región N-terminal de la proteína. EPM2B codifica la proteína denominada malina, una E3 ubiquitin ligasa con un dominio RING en el extremo N-terminal y seis dominios NHL en la región C-terminal que están implicados en interacciones proteína-proteína. La presentación clínica en con mutaciones en uno u otro gen es muy similar, lo que sugiere que ambas proteínas operan en rutas fisiológicas similares. Aunque se conocen las dos principales proteínas que pueden causar la enfermedad, todavía esta muy poco claro cual es el papel fisiológico de ambas proteínas y como su ausencia o defecto pueden provocar efectos tan devastadores en el organismo que indefectiblemente llevan a la muerte de los pacientes afectados de esta enfermedad. El hecho de que uno de los determinantes histológicos que caracterizan la enfermedad de Lafora sea la acumulación de inclusiones intracelulares similares a glucógeno, sugiere que malina y laforina podrían estar involucradas en la regulación de la biosíntesis de glucógeno. Se ha descrito que laforina interacciona físicamente con malina reclutando substratos específicos para ser ubiquitinados por malina. Algunos de estos sustratos están implicados en la regulación de la biosíntesis de glucógeno, tal como la forma muscular de la glucógeno sintasa, la enzima desramificante de glucógeno y alguna subunidad reguladoras glucogénica de la fosfatasa de proteínas de tipo 1 (PP1) como R5/PTG. En esta tesis doctoral se ha descrito la relación funcional entre laforina y malina, las dos proteínas relacionadas con la enfermedad de Lafora, y R6. El complejo formado por laforina y malina es capaz de ubiquitinar a R6 y conducirla a degradación lisosomal. De esta manera, este complejo regula los niveles de proteína presente y la acumulación de glucógeno inducida por R6, controlando así la síntesis de glucógeno promovida por la subunidad reguladora. Dado que la enfermedad de Lafora es una enfermedad neurodegenerativa, hemos abordado por último el estudio del metabolismo de glucógeno en el cerebro. El metabolismo del glucógeno tiene un papel fundamental para el correcto funcionamiento de este órgano, en especial en la cooperación entre neuronas y astrocitos. En periodos de intensa actividad neuronal o durante episodios de hipoglucemia, el astrocito es capaz de generar lactato a partir de glucógeno, el cual puede ser usado por las neuronas adyacentes para continuar su normal funcionamiento. Por tanto, el glucógeno proveniente de los astrocitos provee de una neuroprotección contra la hipoglucemia o isquemia cerebral. En este trabajo hemos determinado que existe una alteración en el metabolismo del glucógeno en astrocitos provenientes de ratones modelo de la enfermedad (KO-malina y KO-laforina) de siete días de edad. En condiciones de crecimiento de alta glucosa, estos astrocitos primarios acumularon más glucógeno que los astrocitos control. Al contrario de lo que sucede con los cuerpos de Lafora, cuando los cultivos de astrocito primario fueron sometidos a ayuno de glucosa, observamos que este glucógeno acumulado se pudo degradar, presentando características similares a las de un glucógeno fisiológico. Además, se ha determinado que esta degradación ocurre mediante la acción de la glucógeno fosforilasa, mostrando que la maquinaría de degradación del glucógeno no está alterada en astrocitos primarios modelos de la enfermedad. Todos estos estudios además de ir encaminados a elucidar los mecanismos de patogenia de la enfermedad de Lafora, pueden ayudar a desvelar un posible tratamiento de la misma por modulación de las subunidades reguladoras glucogénicas de PP1, así como contribuir a una mayor comprensiónp del metabolismo del glucógeno

Phenotypic characterization of a new EPM2A mutation (N163D)

2nd Biennial International Lafora Workshop. La Jolla, California, 23-24 de junio de 2016.Lafora disease (LD, OMIM 254780) is a fatal rare disorder characterized by epilepsy and neurodegeneration. In the vast majority of cases LD is related to mutations in either the EPM2A gene (encoding the glucan phosphatase laforin) or the EPM2B gene (encoding the E3-ubiquitin ligase malin). Alterations in these genes consist of deletions or missense and nonsense mutations. These alterations are spread all over the laforin and malin protein sequences and it remains to be shown whether they correlate with the severity of the disease. We have recently gained access to a primary fibroblast sample form a compound heterozygous EPM2A patient (Y112X/N163D), who shows a slow progression of the disease. As the Y112X mutation is related to regular progression of the disease and to our knowledge the laforin N 163D mutation is novel, here we have carried out the phenotypic characterization of the laforin N163D mutation. We have expressed the laforin-N 163D mutant in bacteria and purified the corresponding protein. Using OMFP as substrate we have observed no major changes in phosphatase activity. The mutant protein was also as stable as wild type when expressed either in bacteria or in mammalian cells. However, it showed a severe impairment in the interaction with regular laforin partners, as laforin itself, malin, R5/PTG and R6 (by yeast two-hybrid assays). Probably, this lack of interaction is the cause of the pathogenic profile of this novel mutation. We have recently reported that human primary fibroblasts from LD patients have an impairment of mitochondrial function with increased production of reactive oxygen species (ROS). In agreement with these observations we found that primary fibroblasts from EPM2A Y112X/N 163D patient presented higher levels of superoxide and lower levels of superoxide dismutase activity. The levels of thioredoxin1 (Trx1) were also decreased in the LD samples. All these results indicate that primary fibroblasts from EPM2A Y112X/N163D patient suffer from oxidative stress.This work was supported by grants from the Spanish Ministry of Education and Science (SAF2014-54604-C3-1-R) and from CIBERER to PS.Peer reviewe

The interaction between AMPK beta 2 and the PP1-targeting subunit R6 is dynamically regulated by intracellular glycogen content

11 páginas, 7 figuras.AMP-activated protein kinase (AMPK) is a metabolic stress-sensing kinase. We previously showed that glucose deprivation induces autophosphorylation of AMPKβ at threonine-148 (Thr-148), which prevents the binding of AMPK to glycogen. Furthermore, in MIN6 cells, AMPKβ1 binds to R6 (PPP1R3D), a glycogen-targeting subunit of protein phosphatase 1 (PP1), thereby regulating the glucose-induced inactivation of AMPK. Here, we further investigated the interaction of R6 with AMPKβ and the possible dependency on Thr-148 phosphorylation status. Yeast two-hybrid analyses and co-immunoprecipitation of the overexpressed proteins in HEK293T cells revealed that both AMPKβ1 and β2 wild-type (WT) isoforms bind to R6. The AMPKβ/R6 interaction was stronger with the muscle-specific β2-WT and required association with the substrate-binding motif of R6. When HEK293T cells or C2C12 myotubes were cultured in high-glucose medium, AMPKβ2-WT and R6 weakly interacted. In contrast, glycogen depletion significantly enhanced this protein interaction. Mutation of AMPKβ2 Thr-148 prevented the interaction with R6 irrespective of the intracellular glycogen content. Treatment with the AMPK activator oligomycin enhanced AMPKβ2/R6 interaction in conjunction with increased Thr-148 phosphorylation in cells grown in low glucose medium. These data are in accordance with R6 binding directly to AMPKβ2 when both proteins detach from the diminishing glycogen particle, which is simultaneous to increased AMPKβ2 Thr-148 autophosphorylation. Such model points to a possible control of AMPK by PP1-R6 upon glycogen depletion in muscle.DN is recipient of a VIDI-Innovational Research Grant from the Netherlands Organization of Scientific Research (NWO-ALW Grant no. 864.10.007). This work has further been supported by grants from the Spanish Ministry of Education and Science SAF2014-54604-C3-1-R and a grant from Generalitat Valenciana (PrometeoII/2014/029) to PS.Peer reviewe

Regulación de la homeostasis del glucógeno: el papel de R6 y la enfermedad de Lafora

Tesis doctoral, 265 p.El glucógeno es la principal reserva de energía en nuestras células y es una molécula esencial para nuestro cerebro. Sin embargo, muchas cuestiones sobre el complejo metabolismo de este carbohidrato siguen por elucidar. Un paso clave en la regulación de la homeostasis del glucógeno es el llevado a cabo por la proteína fosfatasa de tipo 1, PP1. PP1 es capaz de estimular la síntesis de glucógeno mediante la desfosforilación de dos enzimas clave: la glucógeno sintasa (GS) y la glucógeno fosforilasa (GP). La fosfatasa necesita unirse a subunidades reguladoras para el reconocimiento de los diferentes sustratos. En el metabolismo del glucógeno, se han descrito hasta la fecha 7 de estas subunidades reguladoras, siendo R6 una de las más ubicuas y presente mayoritariamente en músculo esquelético, corazón y cerebro. En este trabajo hemos analizado la capacidad glucogénica de R6 en células de neuroblastoma de ratón. Se han estudiado además los diferentes dominios de unión presentes en R6 y su implicación en la regulación de la síntesis de glucógeno. Se ha caracterizado el motivo de unión de R6 a PP1 (R102VRF ) así como la zona de interacción con los diferentes sustratos: GS y GP (W267DNND). La unión a estos dos dominios de interacción ocurre de manera independiente, sin embargo, la pérdida de unión en cualquiera de ellos impide la estimulación de la síntesis de glucógeno producida por R6. Asimismo, hemos definido un nuevo dominio presente en R6 implicado en la unión a las proteínas 14-3-3 (RARS74LP). Esta unión media la regulación de la capacidad glucogénica de R6 ya que, cuando se impide la unión a la subunidad reguladora, la acumulación de glucógeno producida por R6 se ve exacerbada. Además, la unión de las proteínas 14-3-3 a R6 previene su degradación lisosomal, regulando por tanto la estabilidad de la proteína. Este mecanismo de regulación novedoso añadiría un grado más de complejidad a la homeostasis del metabolismo de glucógeno, mostrando una nueva manera de señalización. En este trabajo de tesis doctoral también hemos abordado la regulación del metabolismo del glucógeno en la enfermedad de Lafora (LD. OMIM 254780) y su relación con la subunidad reguladora R6. La enfermedad de Lafora es una enfermedad neurodegenerativa autosómica recesiva que conlleva epilepsia mioclónica progresiva y presenta un desenlace fatal. Debuta durante la adolescencia con ataques generalizados tónico clónicos, mioclonias, ausencias, desvanecimientos y alucinaciones visuales. La enfermedad progresa con demencia progresiva con apraxia, afasia y pérdidas visuales que llevan a los pacientes a un estado vegetativo y a la muerte, que tiene lugar generalmente a los 10 años desde la aparición de los primeros síntomas. Una marca de la enfermedad es la acumulación intracelular de “glucógeno insoluble”, los denominados cuerpos de Lafora. Dichas inclusiones aparecen en el citoplasma de múltiples tejidos entre los que se incluyen cerebro, riñón, piel, hígado y músculo esquelético y cardiaco.La composición de los cuerpos de Lafora se asemeja a la de un glucógeno pobremente ramificado, con características similares a un poliglucosano de plantas, la amilopectina, que le confieren la falta de solubilidad y por tanto, la aparición de inclusiones. Las mutaciones que causan la enfermedad de Lafora han sido identificadas en dos genes EPM2A y EPM2B, aunque hay evidencias de un tercer locus. EPM2A codifica para una fosfatasa dual, la laforina, con un dominio de unión a carbohidratos en la región N-terminal de la proteína. EPM2B codifica la proteína denominada malina, una E3 ubiquitin ligasa con un dominio RING en el extremo N-terminal y seis dominios NHL en la región C-terminal que están implicados en interacciones proteína-proteína. La presentación clínica en con mutaciones en uno u otro gen es muy similar, lo que sugiere que ambas proteínas operan en rutas fisiológicas similares. Aunque se conocen las dos principales proteínas que pueden causar la enfermedad, todavía esta muy poco claro cual es el papel fisiológico de ambas proteínas y como su ausencia o defecto pueden provocar efectos tan devastadores en el organismo que indefectiblemente llevan a la muerte de los pacientes afectados de esta enfermedad. El hecho de que uno de los determinantes histológicos que caracterizan la enfermedad de Lafora sea la acumulación de inclusiones intracelulares similares a glucógeno, sugiere que malina y laforina podrían estar involucradas en la regulación de la biosíntesis de glucógeno. Se ha descrito que laforina interacciona físicamente con malina reclutando substratos específicos para ser ubiquitinados por malina. Algunos de estos sustratos están implicados en la regulación de la biosíntesis de glucógeno, tal como la forma muscular de la glucógeno sintasa, la enzima desramificante de glucógeno y alguna subunidad reguladoras glucogénica de la fosfatasa de proteínas de tipo 1 (PP1) como R5/PTG. En esta tesis doctoral se ha descrito la relación funcional entre laforina y malina, las dos proteínas relacionadas con la enfermedad de Lafora, y R6. El complejo formado por laforina y malina es capaz de ubiquitinar a R6 y conducirla a degradación lisosomal. De esta manera, este complejo regula los niveles de proteína presente y la acumulación de glucógeno inducida por R6, controlando así la síntesis de glucógeno promovida por la subunidad reguladora. Dado que la enfermedad de Lafora es una enfermedad neurodegenerativa, hemos abordado por último el estudio del metabolismo de glucógeno en el cerebro.El metabolismo del glucógeno tiene un papel fundamental para el correcto funcionamiento de este órgano, en especial en la cooperación entre neuronas y astrocitos. En periodos de intensa actividad neuronal o durante episodios de hipoglucemia, el astrocito es capaz de generar lactato a partir de glucógeno, el cual puede ser usado por las neuronas adyacentes para continuar su normal funcionamiento. Por tanto, el glucógeno proveniente de los astrocitos provee de una neuroprotección contra la hipoglucemia o isquemia cerebral. En este trabajo hemos determinado que existe una alteración en el metabolismo del glucógeno en astrocitos provenientes de ratones modelo de la enfermedad (KO-malina y KO-laforina) de siete días de edad. En condiciones de crecimiento de alta glucosa, estos astrocitos primarios acumularon más glucógeno que los astrocitos control. Al contrario de lo que sucede con los cuerpos de Lafora, cuando los cultivos de astrocito primario fueron sometidos a ayuno de glucosa, observamos que este glucógeno acumulado se pudo degradar, presentando características similares a las de un glucógeno fisiológico. Además, se ha determinado que esta degradación ocurre mediante la acción de la glucógeno fosforilasa, mostrando que la maquinaría de degradación del glucógeno no está alterada en astrocitos primarios modelos de la enfermedad. Todos estos estudios además de ir encaminados a elucidar los mecanismos de patogenia de la enfermedad de Lafora, pueden ayudar a desvelar un posible tratamiento de la misma por modulación de las subunidades reguladoras glucogénicas de PP1, así como contribuir a una mayor comprensiónp del metabolismo del glucógeno.Para la realización de esta Tesis, Carla Rubio Villena ha disfrutado de una ayuda del Subprograma de Formación de Personal Investigador (FPI) (BES-2012-053264), Programa de Formación del Ministerio de Economía y Competitividad. El trabajo se ha llevado a cabo en el grupo U742 del CIBERER-Instituto de Salud Carlos III (IP, P. Sanz) enmarcado dentro de los siguientes proyectos de investigación: - Programa Nacional de Biomedicina. Proyecto SAF2011-27442. “Bases moleculares de la fisiopatología de la epilepsia mioclónica progresiva de tipo Lafora. Identificación de nuevos sustratos del complejo laforina-malina” Años 2012-2014. Investigador Principal: Dr. Pascual Sanz. Centro: Instituto de Biomedicina de Valencia (CSIC), Valencia. - Programa Nacional de Biomedicina. Proyecto SAF2014-54604-C3- 1-R. “Buscando una terapia para la epilepsia mioclónica progresiva de Lafora” Años 01/01/2015-31/12/2017. Investigador Principal: Dr. Pascual Sanz. Centro: Instituto de Biomedicina de Valencia (CSIC), Valencia. - Programa de investigación de excelencia Prometeo de la Generalitat Valenciana. Prometeo II/2014/029. “Genes, proteínas y rutas de señalización en enfermedades raras”. Años 2014-2018. Investigador Principal: Dr. Pascual Sanz. Investigadores asociados: Dr. Alberto Marina y Dr. Vicente Rubio. Centro: Instituto de Biomedicina de Valencia (CSIC), Valencia Durante la realización de esta tesis doctoral, la autora ha disfrutado de una Ayuda a la movilidad predoctoral para la realización de estancias breves en centros de I+D (dentro del Subprograma Estatal de Movilidad) referencia EEBB-I-15-09350 del Ministerio de Economía y Competitividad.Peer reviewe

Glycogenic activity of R6, a protein phosphatase 1 regulatory subunit, is modulated by the laforin-malin complex

10 páginas, 7 figuras.Protein phosphatase type 1 (PP1) plays a major role in the regulation of glycogen biosynthesis. PP1 is recruited to sites of glycogen formation by its binding to specific targeting subunits. There, it dephosphorylates different enzymes involved in glycogen homeostasis leading to an activation of glycogen biosynthesis. Regulation of these targeting subunits is crucial, as excess of them leads to an enhancement of the action of PP1, which results in glycogen accumulation. In this work we present evidence that PPP1R3D (R6), one of the PP1 glycogenic targeting subunits, interacts physically with laforin, a glucan phosphatase involved in Lafora disease, a fatal type of progressive myoclonus epilepsy. Binding of R6 to laforin allows the ubiquitination of R6 by the E3-ubiquitin ligase malin, what targets R6 for autophagic degradation. As a result of the action of the laforin-malin complex on R6, its glycogenic activity is downregulated. Since R6 is expressed in brain, our results suggest that the laforin-malin complex downregulates the glycogenic activity of R6 present in neuron cells to prevent glycogen accumulation.This work was supported by a grant from the Spanish Ministry of Education and Science (SAF2011-27442), a grant from la Fundació La Marato de TV3 (ref. 100130) and a grant from Generalitat Valenciana (Prometeo 2009/051).Peer reviewe

Structure-Function Analysis of PPP1R3D, a Protein Phosphatase 1 Targeting Subunit, Reveals a Binding Motif for 14-3-3 Proteins which Regulates its Glycogenic Properties

17 páginas, 7 figuras, 1 tabla.Protein phosphatase 1 (PP1) is one of the major protein phosphatases in eukaryotic cells. It plays a key role in regulating glycogen synthesis, by dephosphorylating crucial enzymes involved in glycogen homeostasis such as glycogen synthase (GS) and glycogen phosphorylase (GP). To play this role, PP1 binds to specific glycogen targeting subunits that, on one hand recognize the substrates to be dephosphorylated and on the other hand recruit PP1 to glycogen particles. In this work we have analyzed the functionality of the different protein binding domains of one of these glycogen targeting subunits, namely PPP1R3D (R6) and studied how binding properties of different domains affect its glycogenic properties. We have found that the PP1 binding domain of R6 comprises a conserved RVXF motif (R102VRF) located at the N-terminus of the protein. We have also identified a region located at the C-terminus of R6 (W267DNND) that is involved in binding to the PP1 glycogenic substrates. Our results indicate that although binding to PP1 and glycogenic substrates are independent processes, impairment of any of them results in lack of glycogenic activity of R6. In addition, we have characterized a novel site of regulation in R6 that is involved in binding to 14-3-3 proteins (RARS74LP). We present evidence indicating that when binding of R6 to 14-3-3 proteins is prevented, R6 displays hyper-glycogenic activity although is rapidly degraded by the lysosomal pathway. These results define binding to 14-3-3 proteins as an additional pathway in the control of the glycogenic properties of R6.This work has been supported by grants from the Spanish Ministry of Education and Science SAF2011-27442 and a grant from Generalitat Valenciana (PrometeoII/2014/029). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.Peer reviewe

Analysis of the interacting properties of different domains of R6 by immunoprecipitation (GFP-Trap) in mammalian cells.

<p>Hek293 cells were transiently transfected with expression vectors coding for YFP, YFP-R6 wild type, and the corresponding mutants YFP-R6 RARA and YFP-R6 RAHA (A), YFP-R6 WDNAD and YFP-R6 WANNA (B), or YFP-R6 S25A and YFP-R6 S74A plasmids (C). Immunoprecipitation analyses were performed using GFP-Trap system (see <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0131476#sec002" target="_blank">Materials and Methods</a> section). 40 μL of eluted beads and thirty micrograms of total protein from the soluble fraction of cell lysates (input) were analyzed by SDS-PAGE and Western blotting using appropriated antibodies.</p

Subcellular localization of R6 S25A and R6 S74A mutated forms.

<p>N2a cells were transfected with pYFP empty plasmid, pYFP-R6 wild type, pYFP-R6 S25A or pYFP-R6 S74A plasmids. The subcellular localization of R6 forms and glycogen granules was carried out as described in Materials and Methods. Images were obtained by using confocal microscopy (bars indicate 10 μm). Images corresponding to visible, YFP (in yellow) and glycogen (in red) fluorescences are shown.</p

Schematic representation of the different binding regions in R6.

<p>R6 possesses three separated interaction domains: PP1c binding motif (R₁₀₂VRF), PP1 substrate binding region (W₂₆₇DNND) and 14-3-3 binding motif (RARS₇₄LP). GS, glycogen synthase; GP, glycogen phosphorylase.</p

Analysis of the interacting properties of different domains of R6 by yeast two-hybrid analyses.

<p>Upper panels: yeast THY-AP4 strain was transformed with plasmids pBTM-R6 wt (LexA-R6), pBTM-R6 RARA and pBTM-R6 RAHA (A), pBTM-R6 WDNAD, and pBTM-WANNA (B) or pBTM-R6 S25A and pBTM-R6 S74A (C) and with pACT2 (GAD), pACT2-PP1α (GAD-PP1α), pACT2-laforin (GAD-laforin) or pACT2-14-3-3ε (GAD-14-3-3ε). Protein interaction was estimated by measuring the β-galactosidase activity. Values correspond to means from at least 6 different transformants (bars indicate standard deviation). Lower panels: protein expression in yeast transformants was analyzed by Western blotting using anti-HA antibodies (for the GAD-fusions) and anti-LexA (for the LexA-fusions) in several transformants from each condition. A representative western blot of some of these transformants is shown.</p