Optimization of the cultivation conditions for the production of an antimicrobial compound by Trichosporon japonicum QU139

Strain Trichosporon japonicum QU139 showed antimicrobial activity against several pathogenic fungi, and has good potential for being used in the development of a new antimicrobial agent. The objective of this work was to optimize the conditions for the production and detection of the antimicrobial compound produced by this strain. The antimicrobial effect was evaluated by the well method against sensitive cells of Cryptococcus gattii C20 in GYP and YM media at different pH values. GYP medium at pH 4.5 ± 0.5 and 24h of incubation, at 25ºC and 150 rpm, were defined as the best medium and cultivation conditions. The methodologies employed for the isolation and concentration of the antimicrobial compound were negative for antimicrobial activity, suggesting that it may not have a protein nature. The nature of the compound needs to be fully explored, and other methodologies, especially the ones for purification of glycolipids, must be employed in order to obtain a purified compound for biotechnological purposes.(Otimização das condições de cultivo para a produção de um composto antimicrobiano por Trichosporon japonicum QU139). A cepa Trichosporon japonicum QU139 mostrou atividade antimicrobiana contra vários fungos patogênicos, tendo um bom potencial para o desenvolvimento de um novo agente antimicrobiano. O objetivo do trabalho foi a otimização da produção e detecção do composto antimicrobiano. O efeito antimicrobiano foi avaliado pelo método de poços contra células sensíveis de Cryptococcus gattii C20 em meios GYP e YM em diferentes pH. O meio GYP, em pH 4.5 ± 0.5 e 24h de incubação a 25ºC e 150 rpm, foram definidos como o melhor meio e condições de cultivo. As metodologias empregadas para isolamento e concentração do composto antimicrobiano foram negativas para atividade antimicrobiana, sugerindo que ele possa não ter natureza protéica. A natureza do composto precisa ser mais bem explorada e outras metodologias, especialmente as utilizadas em purificação de glicolipídeos, devem ser empregadas para obter um composto purificado visando aplicações biotecnológicas

Morfogenese in vitro e micropropagação de Aspidosperma polyneuron Mull. Arg. (Peroba-rosa)

Orientador: Flavio ZanetteTese (doutorado) - Universidade Federal do Parana, Setor de Ciencias AgrariasÁrea de concentração: SilviculturaRESUMO No presente trabalho estudou-se a morfogênese in vitro e os fatores que controlam a organogênese e embriogênese somática para estabelecer um protocolo de micropropagação de Aspidosperma polyneuron. Foram realizados experimentos com hipoclorito de sódio e bicloreto de mercúrio para desinfestação de brotações apicais e sementes visando o estabelecimento de culturas assépticas. No estudo da organogênese, brotações apicais de mudas de dois anos de idade, mantidas em casa de vegetação, foram avaliadas na indução de brotações múltiplas em meio de cultura WPM, suplementado com BAP, ZEA ou Cin (2,2-8,8 uM), no cultivo inicial e em dois subcultivos. Explantes do epicótilo e hipocótilo de sementes germinadas in vitro também foram testados em meio de cultura WPM, acrescido de BAP (2,5-10,0 uM), combinado ou não com AIB ou ANA (0,5 uM), durante três subcultivos. Para indução de brotações alongadas foram testadas combinações de fitorreguladores 2,25 uM de BAP, ZEA ou Cin, com 1,25 uM de AIB. A indução de raízes foi avaliada com tratamentos pulsos de soluções de AIB (2,5-10 mM), durante 5 ou 15 minutos. As mudas enraizadas foram plantadas em casa-de-vegetação climatizada. O estudo da embriogênese somática foi realizado visando determinar a melhor fonte de explantes, o estado fisiológico, a influência das formulações salinas, dos fitorreguladores, da consistência dos meios de cultura e o tempo necessário para expressão das respostas morfogenéticas. Avaliações histológicas e citoquímicas foram realizadas para caracterizar __ células embriogenéticas e embriões somáticos em vários estádios de desenvolvimento.! A desinfestação de brotações apicais foi eficiente com 0,25% de NaOCl ou 0,05% de HgCh. durante 10 minutos e das sementes com 1 % de NaOCl, durante 20 minutos, sendo obtida 72,89%, 70-90% e 90% de sobrevivência, respectivamente. Em todas as estações do ano foram estabelecidas culturas assépticas, apesar de que na primavera e verão foram obtidos os melhores resultados. Brotações apicais induziram as maiores taxas médias de regeneração de brotações axilares (4 a 5) em meio de cultura WPM, suplementado com ZEA ou BAP (4,4-8,8 uM), após o segundo subcultivo. Concentrações mais reduzidas de BAP ou ZEA (2,25 uM) e 1,25 uM de AIB proporcionaram em média, três brotações mais alongadas. Os explantes provenientes da região do hipocótilo apresentaram taxas médias de regeneração de brotações e percentagens de enraizamento mais elevadas do que os do epicótilo. Os maiores números médios de brotações (7 a 8) ocorreram em meio de cultura, acrescido de 10 uM de BAP no terceiro subcultivo. A presença de 0,5 uM de AIB ou ANA, combinadas com BAP (2,5; 5 e 10 uM) não afetaram as taxas médias de regeneração de brotações. Tratamentos pulsos com soluções de 10 mM de AIB, durante 15 minutos foram eficientes na indução de raízes (80%) e as mudas transplantadas apresentaram taxas de sobrevivência superiores a 900/0, em casa de vegetação climatizada. A indução e desenvolvimento de embriões somáticos ocorreu a partir de embriões maduros e imaturos inoculados em meios de cultura semi-sólidos (LPm, WPM e MS), suplementados com 2,4-D (5 ou 10 uM) e 0,5 uM de Cin, BAP ou TDZ, na ausência de luz. A indução e expressão da rota de embriogênese somática de culturas primárias foi de baixa freqüência e de forma assincrônica. Foram observados os padrões diretos e indiretos de expressão da embriogênese somática dependendo do estado fisiológico dos embriões inoculados. O período médio, que iniciaram os eventos da embriogênese somática, for de 12 a 16 semanas após a inoculação. O estabelecimento e manutenção de linhagens celulares embriogenéticas ocorreu em meio de cultura LPm, suplementado com 0,5 uM de 2,4-0 ou ANA e 0,5 uM de Cin, sendo estabelecidos ciclos repetitivos de divisão celular por mais de três anos, permitindo o "scale-up" de culturas embriogenéticas. A maturação dos embriões somáticos ocorreu em meio de cultura LPm, suplementado com 12,30 uM ou 24,60 uM de 2-iP e 0,5 uM de ANA e das linhagens celulares embriogenéticas com 30 uM de ABA. Avaliações citoquímicas permitiram a caracterização de células embriogenéticas e indicaram a presença de corpúsculos lipídicos e grãos de amido. Avaliações histológicas permitiram caracterizar células embriogenéticas e embriões somáticos em vários estádios ontogenéticos.ABSTRACT This work studied morphogenesis in vitro, organogenesis and somatic embryogenesis regulation to establish a micropropagation protocol of Aspidosperma polyneuron. Apical shoots and seeds were desinfested with NaOCl and HgC^ to establish aseptic cultures. Apical shoots were used to evaluate induction of multiple shoots in WPM medium, supplemented with ZEA, BAP and Kin (2.2-8.8fiM). Epicotyl and hipocotyl expiants were tested in WPM medium with BAP (2.5, 5.0, 10.0 |xM), with and without IBA or NAA (0.5 \M). IBA pulse treatments (2.5, 5.0, 10.0 mM) were tested at 5 and 15 minutes to induce roots. Plantlets were planted in a climatized greenhouse. Somatic embryogenesis studies were established to determine the expiants, the physiological state of the expiants, the influence of the culture medium consistency, salts formulations, phytoregulators and the necessary time to induction and expression of the morphogenetic responses. Cytochemical and histologycal evaluations were performed to characterize embryogenic cells and the stages of somatic embryos development. Efficient apical shoots disinfestation were achieved with NaOCl (0.25%-10 minutes) or HgCb (0,05%-10 minutes) and seed disinfestation with NaOCl (l%-20 minutes); survival rates were 72.89%, 70-90% and 90%, respectively. Spring and summer had the highest survival rates. Apical shoots induced 4-5 axillary buds in WPM culture medium, containing ZEA or BAP (4.4-8.8 |iM) following two subcultures. Reduced concentrations of ZEA or BAP (2.25 |xM), combined with IBA (1.25 jiM) produced long shoots. Hipocotyl expiants showed an increase of the shoot regeneration and the rooting percentages, as compared to epicotyls explants. Explants of the epicotyl and hipocotyl induced multiple shoots (7-8) in culture medium supplemented with 10.0 (¿M de BAP on the third subculture. The addition of 0.5 |iM IBA or NAA, combined with BAP concentrations did not influence regenerations rates. IBA pulse treatment (10.0 mM) during 15 minutes induced higher rooting percentages (80%). Plantlets planted in a climatized greenhouse showed higher survival rates (90%). Somatic embryo induction occurred from mature and immature embryos inoculated on semi-solid culture media (LPm, WPM and MS), supplemented with 2,4-D (5.0 or 10.0 |iM) plus Kin, TDZ or BAP (0.5 |iM) at dark conditions. The induction and expression of primary cultures occurred asynchronously and in relatively small proportions of cultures. Direct and indirect patterns of somatic embryogenesis were observed depending of the physiological stage of the expiants. The establishment and scale-up of embryogenic cell lines occurred in LPm culture medium, supplemmented with 2,4-D or NAA (0.5 |iM) plus Kin (0.5 |iM) for periods longer than three years. Somatic embryos maturation occurred in LPm culture medium supplemented with 2-iP (12.30-24.60 |iM) plus ANA (0.5 |oM) or ABA (30 |iM) to maturation of embryogenic cell lines. Cytochemical studies showed the accumulation of lipid and starch bodies in the embryogenic cells. Histological studies allowed characterization of embryogenic cells and of the stages of somatic embryos. semi-solid culture media (LPm, WPM and MS), supplemented with 2,4-D (5.0 or 10.0 uM) plus Kin, TDZ or BAP (0.5 uM) at dark conditions. The induction and expression of primary cultures occurred asynchronously and in relatively small proportions of cultures. Direct and indirect patterns of somatic embryogenesis were observed depending of the physiological stage of the explants. The establishment and scale-up of embryogenic cell lines occurred in LPm culture medium, supplemmented with 2,4-D or NAA (0.5 uM) plus Kin (0.5 uM) for periods longer than three years. Somatic embryos maturation occurred in LPm culture medium supplemented with 2-iP (12.30-24.60 uM) plus ANA (0.5 uM) or ABA (30 uM) to maturation of embryogenic cell lines. Cytochemical studies showed the accumulation of lipid and starch bodies in the embryogenic cells. Histological studies allowed characterization of embryogenic cells and of the stages of somatic embryos

Otimização das condições de cultivo para a produção de um composto antimicrobiano por Trichosporon japonicum QU139

Strain Trichosporon japonicum QU139 showed antimicrobial activity against several pathogenic fungi, and has good potential for being used in the development of a new antimicrobial agent. The objective of this work was to optimize the conditions for the production and detection of the antimicrobial compound produced by this strain. The antimicrobial effect was evaluated by the well method against sensitive cells of Cryptococcus gattii C20 in GYP and YM media at different pH values. GYP medium at pH 4.5 ± 0.5 and 24h of incubation, at 25ºC and 150 rpm, were defined as the best medium and cultivation conditions. The methodologies employed for the isolation and concentration of the antimicrobial compound were negative for antimicrobial activity, suggesting that it may not have a protein nature. The nature of the compound needs to be fully explored, and other methodologies, especially the ones for purification of glycolipids, must be employed in order to obtain a purified compound for biotechnological purposes.A cepa Trichosporon japonicum QU139 mostrou atividade antimicrobiana contra vários fungos patogênicos, tendo um bom potencial para o desenvolvimento de um novo agente antimicrobiano. O objetivo do trabalho foi a otimização da produção e detecção do composto antimicrobiano. O efeito antimicrobiano foi avaliado pelo método de poços contra células sensíveis de Cryptococcus gattii C20 em meios GYP e YM em diferentes pH. O meio GYP, em pH 4.5 ± 0.5 e 24h de incubação a 25ºC e 150 rpm, foram definidos como o melhor meio e condições de cultivo. As metodologias empregadas para isolamento e concentração do composto antimicrobiano foram negativas para atividade antimicrobiana, sugerindo que ele possa não ter natureza protéica. A natureza do composto precisa ser mais bem explorada e outras metodologias, especialmente as utilizadas em purificação de glicolipídeos, devem ser empregadas para obter um composto purificado visando aplicações biotecnológicas

Embriogênese somática e morfoanatomia de embriões somáticos de Ocotea porosa

http://dx.doi.org/10.5902/1980509812343Ocotea porosa seeds have strong tegument dormancy, recalcitrant behavior, low and irregular germinationand that makes its natural propagation difficult. The aim of this study was to establish a protocol ofregeneration of Ocotea porosa from somatic embryogenesis. Immature embryonic axes were inoculatedon WPM culture medium supplemented with 2.4-D (200 μM) combined or not with hydrolyzed casein orglutamine (0.5 or 1 g l-1), during 90 days. The repetitive embryogenesis was induced on medium with 2.4-D(22.62 μM) combined with 2-iP (2.46 μM) followed by transfer to culture medium with hydrolyzed caseinor glutamine (1 g l-1) during 90 days. The maturation of somatic embryos was tested in culture mediumcontaining NAA (0.5 μM) and 2-iP (5; 10 and 20 μM). The highest percentage of somatic embryos induction(8.3%) was observed in WPM culture medium containing 200 μM 2.4-D and 1 g L-1 hydrolyzed casein andthe development of somatic embryos occurred indirectly. Repetitive somatic embryogenesis was promotedin WPM medium containing hydrolyzed casein or glutamine. However, the culture medium containinghydrolyzed casein promoted the maintenance of embryogenic capacity for more than two years. Duringthe maturity phase, there was a low progression of globular embryos to cordiform and torpedo stages.The different ontogenetic stages of somatic embryos of Ocotea porosa were characterized by histologicalstudies.http://dx.doi.org/10.5902/1980509812343Ocotea porosa apresenta sementes com forte dormência tegumentar, comportamento recalcitrante, baixa germinação e irregularidade, o que dificulta a propagação natural. O objetivo deste trabalho foi estabelecer um protocolo de embriogênese somática para Ocotea porosa. Eixos embrionários zigóticos imaturos foram inoculados em meio de cultura WPM suplementado com 2,4-D (200 μM) combinado ou não com caseína hidrolisada ou glutamina (0,5 ou 1 g l-1) durante 90 dias. A embriogênese repetitiva foi induzida em meio contendo 2,4-D (22,62 μM) combinado com 2-iP (2,46 μM) seguido de transferência para meio de cultura com caseína hidrolisada ou glutamina (1 g l-1), durante 90 dias cada. A maturação dos embriões somáticos foi testada em meio de cultura contendo ANA (0,5 μM) e 2-iP (5, 10 ou 20 μM). A maior porcentagem de embriões somáticos induzidos (8,3%) foi observada em meio de cultura WPM contendo 200 μM de 2,4-D e 1 g l-1 de caseína hidrolisada e o desenvolvimento de embriões somáticos ocorreram de forma indireta. A embriogênese somática repetitiva foi promovida em meio de cultura WPM contendo caseína hidrolisada ou glutamina, no entanto, a caseína hidrolisada promoveu a manutenção da competência embriogênica por mais de dois anos. Na fase de maturação, houve baixa progressão dos embriões globulares para os estádios cordiforme e torpedo. Os diferentes estádios ontogenéticos de embriões somáticos de Ocotea porosa foram caracterizados pelo estudo histológico

Embriogênese somática de peroba-rosa (Aspidosperma polyneuron MULL.ARG.)

Orientadora: Luciana Lopes Fortes RibasAproveitado CD do autorMonografia (Bacharelado) - Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciencias Biológicas. Curso de Graduaçao em Ciencias BiológicasResumo : A peroba-rosa (Aspidosperma polyneuron) é uma espécie florestal a qual, devido à qualidade de sua madeira, foi amplamente utilizada na construção civil e na indústria de móveis. Atualmente, a espécie se encontra ameaçada de extinção e necessitando com urgência de programas de conservação. Sua propagação por métodos convencionais é difícil devido a sua produção irregular de frutos (a cada 2-4 anos) e difícil enraizamento em estacas. A embriogênese somática é uma técnica de cultivo in vitro que permite a propagação massal de plantas. O objetivo deste trabalho foi contribuir para a otimização dos protocolos de embriogênese somática de peroba-rosa a partir de embriões zigóticos imaturos, testando-se diferentes concentrações de reguladores vegetais e diferentes agentes geleificantes. Para a indução da embriogênese somática, foram testadas as combinações de 5,0 µM ou 10,0 µM de 2,4-D com 0,5 µM ou 2,5 µM de CIN ou de BAP, em meio de cultura WPM semi-sólido (4 gL-1 de ágar Micromed® ou 2 gL-1 de gelrite), acrescido ou não de caseína hidrolisada e L-glutamina (0,5 gL-1 cada). Após 10 a 12 semanas, as culturas foram subcultivadas para meios com 1/4 ou 1/10 da concentração de 2,4-D. A formação de massas embriogênicas foi observada nos embriões mais imaturos, após o subcultivo para meio de cultura com redução da concentração de 2,4-D. A embriogênese somática direta e indireta (com maior freqüência) foi obtida a partir de embriões bem imaturos após 12 semanas de indução em meio WPM, acrescido de gelrite (2 gL-1), caseína hidrolisada e L-glutamina, com 5,0 µM de 2,4-D e 2,5 µM de CIN, seguido de transferência para meio com 1,25 µM de 2,4-D e 2,5 µM de CIN. O meio de maturação com 10,0 µM de 2-iP e 0,5 µM de ANA têm permitido a formação de novos embriões somáticos e o desenvolvimento dos embriões para os estádios cordiforme e torpedo. Para o estabelecimento de um protocolo de embriogênese somática há necessidade de mais estudos para as etapas de maturação e conversão de embriões somáticos em plantas

Acclimatization of 'VR043-43' (Vitis vinifera x Vitis rotundifolia) grapevine rootstock

The pre-acclimatization stage can be used to improve micropropagation protocols and increase the yield of produced plants. The influence of sucrose and photon flux density (PFD) levels on the acclimatization of in vitro-grown 'VR043-43' (Vitis vinifera x Vitis rotundifolia) grapevine rootstocks was evaluated. Rooted shoots were obtained from 4-week-old in vitro shoots cultivated in QL (Quoirin and Lepoivre, 1977) culture medium supplemented with 15, 30 and 45 g L-1 of sucrose. The experiment was kept in a 25 ± 2ºC growth room, under 16-h photoperiod and PFD of 18 µmol m-2 s-1 or 43 µmol m-2 s-1. Plants were transferred to an intermittent misting system greenhouse for 10 d followed by 20 d of once-a-day watering routine using a handheld hose. Plant height was influenced by sucrose concentration, and shoots produced on media supplemented with 30 g L-1 sucrose were the tallest (5.0 cm). The largest leaf area was obtained with 31.3 g L-1 of sucrose, under the PFD of 43 µmol m-2 s-1 (13.3 cm²). Absence of sucrose in the culture medium led to a significant reduction in leaf area at both PFDs. Shoot (aerial part) dry matter was largest when 30 or 45 g L-1 of sucrose (17.5 and 16.7 mg per plant, respectively) were used. Microcuttings rooted in all sucrose concentrations tested. The highest survival percentage (100%) during ex vitro acclimatization was obtained for shoots cultured in media supplemented with 45 g L-1 of sucrose under both PFDs tested.A fase de pré-aclimatização pode ser utilizada para aperfeiçoar os protocolos de micropropagação e aumentar o rendimento na produção de mudas. Avaliou-se a influência da sacarose e níveis de densidade de fluxo de fóton (DFF) in vitro, na sobrevivência das mudas do porta-enxerto de videira 'VR043-43'(Vitis vinifera x Vitis rotundifolia), na fase de aclimatização. Microestacas obtidas de brotações in vitro foram cultivadas em meio de cultura QL suplementado 15, 30 e 45 g L-1 de sacarose. O experimento foi mantido em sala climatizada com temperatura de 25 ± 2ºC, fotoperíodo de 16 horas e DFF de 18 µmol m-2 s-1 ou 43 µmol m-2 s-1. As plantas foram transferidas para uma câmara de nebulização intermitente por 10 d e mantidas durante 20 d em casa de vegetação com irrigação manual. A altura das plantas foi influenciada pelas concentrações de sacarose, sendo a maior altura (5,0 cm) obtida com a concentração de 30 g L-1 de sacarose. A maior área foliar foi obtida com 31,3 g L-1 de sacarose na DFF de µmol m-2 s-1 (13,3 cm²). A ausência de sacarose no meio de cultura promoveu redução significativa na área foliar nas duas DFFs testadas. A matéria seca da parte aérea foi maior quando o meio de cultura foi suplementado com 30 ou 45 g L-1 de sacarose (17,5 e 16,7 mg por planta, respectivamente). Houve enraizamento das microestacas em todas as concentrações de sacarose testadas. Alta porcentagem de sobrevivência (100%) durante a aclimatização ex vitro foi obtida quando as brotações foram cultivadas no meio de cultura suplementado com 45 g L-1 de sacarose em ambas DFFs testadas

Asymbiotic seed germination and in vitro propagation of Brasiliorchis picta

Seed storage method for in vitro germination and propagation from leaves of Brasiliorchis picta was developed. Seeds were harvested and stored at -20 and -80°C for 1, 3, 6, and 12 months and were germinated on Knudson C (KC), Murashige and Skoog (MS), half-strength MS (½ MS macro- and micro-nutrients), and woody plant medium (WPM). Seeds stored at -20°C, the recommended temperature for seed banks, had a high germination rate (76.0%) when cultivated in WPM after 12 months of storage. WPM is the best medium for seed germination and seedling development for both harvested and stored seeds, regardless of storage time and storage temperature. Whole leaf and leaf transversal thin cell layers (tTCL) from 3-month-old in vitro grown protocorms were cultured in ½ MS supplemented with 6-benzyladenine (BA; 2.5, 5.0 and 10.0 μM) and thidiazuron (TDZ; 3.0, 6.0 and 9.0 μM) for 12 weeks. The highest frequency of regenerated protocorm-like bodies (PLBs) from explants (70.0%) occurred when whole leaves were cultured in medium containing 5.0 μM BA, whereas the best response for leaf TCL was with the basal section in medium containing 9 μM TDZ, in which PLBs developed in all regions of leaves. Plantlets were successfully acclimatized (with a survival rate of 97%) when vermiculite was used as a substrate.Key words: Endangered species, conservation, germination rate, leaf explant, culture medium, micropropagation, Orchidaceae, thin cell layer

A Dama de Caio: Interfaces entre Literatura e Sociologia

Este trabalho busca a aproximação entre a literatura e asociologia. A análise problematizará o conto Dama daNoite, de Caio Fernando Abreu, do livro Os Dragões nãoConhecem o Paraíso (1988). Os elementos que articularãoa conexão entre as áreas serão os pressupostos de identidadepresentes na obra. Mediante o entendimento deidentidade a partir de uma lógica pós-moderna, por meiode uma pesquisa bibliográfica, o marco teórico do ensaioserá o livro A Identidade Cultural na Pós-Modernidade(2002), de Stuart Hall, e a obra Identidade (2005), deZygmunt Bauman. Valendo-se de um narradorautodiegético, Caio dá vida à dama. As questões de identidade permeiam todo o conto, na fala da personagem.Entendemos como possível a aproximação entre a literaturae a sociologia, neste conto, porque é nítido um universoque está para além do literário, demonstrando demaneira clara a função social da literatura