Clonagem de genes ureG putativos de Glomus intraradices e atividades de urease em raízes micorrízicas arbusculares de tabaco

Even though the major benefit of arbuscular mycorrhizae is the increased uptake of phosphate from the soil solution and translocation to the plant, changes in the activity of enzymes involved in nitrogen (N) metabolism have been detected in mycorrhizal roots. Using differential display of reverse-transcripts of tobacco roots not-inoculated or inoculated with Glomus intraradices (Gi), we have cloned two partial cDNAs (NtGi2 and NtGi3). The presence of a conserved CobW/HypB/UreG domain and phylogenetic analyses suggest that NtGi2 and NtGi3 encode isoforms of urease accessory protein G (ureG) highly similar to ureG from fungi. The steady state levels of the putative ureG transcripts were shown to be higher in roots colonized by Gi, as compared to non-mycorrhizal controls. Urease activities were also determined in tobacco roots inoculated with Glomus clarum (Gc) or Gi and grown in substrate containing 50, 100 or 150 mg N kg-1 in the form of ammonium sulfate (N-AMS) or urea (N-URE). Urease activities were shown to be induced in mycorrhizal roots fertilized with 100 mg N-AMS kg-1. In Gc-colonized roots fertilized with N-URE, induction of urease activities was observed at the lowest N concentration. In contrast, at the highest N-URE concentration, suppression of urease activities was observed in Gc and Gi-colonized roots, as compared to non-mycorrhizal controls. Urease activities in roots were modulated by soil N availability and source, and arbuscular mycorrhizal fungal inoculation.Muito embora o maior benefício de micorrizas arbusculares seja o incremento na absorção de fosfato da solução do solo e translocação para a planta, alterações nas atividades de enzimas envolvidas no metabolismo de nitrogênio (N) têm sido detectadas em raízes micorrizadas. Usando differential display of reverse-transcripts de raízes de tabaco não-inoculadas ou inoculadas com Glomus intraradices (Gi), dois cDNAs parciais (NtGi2 e NtGi3) foram clonados. A presença de um domínio CobW/HypB/UreG conservado e a análise filogenética sugerem que NtGi2 e NtGi3 codificam isoformas de proteínas acessórias da urease G (ureG) altamente similares a ureG de fungos. Os níveis de transcritos dos genes ureG putativos foram mais elevados em raízes colonizadas por Gi, em relação ao controle não-micorrizado. As atividades de urease foram determinadas em raízes de tabaco inoculadas com Glomus clarum (Gc) ou Gi e cultivadas em substrato contendo 50, 100 ou 150 mg N kg-¹, na forma de sulfato de amônio (N-AMS) ou uréia (N-URE). As atividades de ureases foram induzidas em raízes micorrizadas cultivadas com 100 mg N-AMS kg-¹. Em raízes colonizadas por Gc e cultivadas com N-URE, a indução das atividades de urease foi observada na concentração mais baixa de N. Em contraste, na concentração mais elevada de N-URE, supressão das atividades de urease em raízes colonizadas por Gc e Gi, em relação aos controles não-micorrizados, foi observada. As atividades de urease nas raízes foram moduladas pela disponibilidade e fonte de N no solo, e pela inoculação com fungos micorrízicos arbusculares.FAPESPCNPqCoordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de Nivel Superior (CAPES

Analysis of plant gene expression responses to the pathogen and natural genetic engineer Agrobacterium tumefaciens

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2004Agrobacterium tumefaciens genetically transforms its natural plant host and other eukaryotic cells, representing both an intriguing pathogen and a vehicle for genetic engineering. Host responses to this bacterium have not been studied extensively in the past, although this understanding is critical for both practical applications in biotechnology and insights into host-microbe interaction. Here we present a study of plant gene expression responses to Agrobacterium infection. Two different plant species and two different large-scale approaches have been used to identify genes with altered expression during infection. By cDNA-AFLP we identified several transcripts from Ageratum conyzoides cell cultures that were regulated at 24 and 48 hours after infection with Agrobacterium . A number of these transcripts code for plant defense-related proteins which are also regulated by a non-pathogenic bacterium. However, a nodulin-like gene was regulated uniquely by Agrobacterium, suggesting that the closely-related symbiotic Rhizobium and Agrobacterium can provoke similar responses in plants. We observed that an attachment-deficient Agrobacterium mutant hyper-induces a set of plant defense genes and we propose that Agrobacterium can dampen plant defense responses by an attachment-dependent mechanism. The plant defense system is likely important in regulating infection since Ageratum cells with heightened defenses hinder transformation. By using microarrays, we also investigated the transcriptome of Arabidopsis thaliana cell cultures during a time-course of infection by Agrobacterium. Statistically significant alterations in gene expression are observed at 48 hours after infection, but not at earlier time points. The identity of the differentially expressed genes suggests similarities with classes of genes characterized in our previous studies and with other defense-related genes. Future microarray studies comparing infection with other pathogens, symbionts and various Agrobacterium mutants will further advance our understanding of this fascinating plant-bacterium interaction

not available

Com o objetivo de compreender os mecanismos que regulam a formação da simbiose entre fungos micorrízicos arbusculares e raízes de plantas, procurou-se identificar e clonar genes com expressão diferencial na interação através da técnica do"display"diferencial de cDNAs. Raízes de fumo (Nicotiana tabacum) não colonizadas e colonizadas pelo fungo Glomus intraradices foram coletadas, após um período experimental de oito semanas, para a extração de RNA. Em seguida, iniciadores com base na seqüência poliadenílica do RNA mensageiro de eucariotos (oligo-dTs) foram utilizados para a síntese de cDNA. Iniciadores aleatórios ou combinações de iniciadores aleatórios e oligo-dTs foram utilizadas para amplificar, por PCR, a primeira fita de cDNA. Três produtos de amplificação presentes somente em amostras de raízes colonizadas foram identificados e clonados. Os clones foram seqüenciados e suas seqüências comparadas às seqüências de genes conhecidos. O clone NtGil apresentou 55 a 70% e 33 a 66% de identidade em nível de nucleotídeos e aminoácidos, respectivamente, com genes que codificam proteínas acessórias da urease (UreG), de várias bactérias e Arabidopsis. O clone NtGi2 também apresentou alta homologia (55 a 66% em nível de nucleotídeos e 41 a 65% em nível de aminoácidos) com proteínas UreG de várias bactérias. Esse clone é praticamente idêntico à NtGil, diferindo apenas por uma inserção de 74 nucleotídeos, entre as posições 534 e 607. A seqüência de nucleotídeos do clone NtGi3 é idêntica à sequência de NtGil, exceto pelo fato do clone NtGil abranger uma porção maior da região 3 do gene. A análise da seqüência de aminoácidos deduzida revelou a presença de sítios putativos de N-glicosilação (NYSR e NKTD), de ligação ATP/GTP (GPVGSGKT,"P-loop") e de fosforilação por quinase-tirosina (RELADYIIY). Os sítios de glicosilação e de ligação ATP/GTP são conservados entre as proteínas UreG armazenadas nos bancos de dados. No entanto, o sítio de fosforilação é específico para os cDNAs isolados. Com base nos resultados obtidos, é possível que as proteínas UreG estejam envolvidas no metabolismo do nitrogênio durante a simbiose ou ainda com a infectividade do fungo.not availabl

not available

Com o objetivo de compreender os mecanismos que regulam a formação da simbiose entre fungos micorrízicos arbusculares e raízes de plantas, procurou-se identificar e clonar genes com expressão diferencial na interação através da técnica do"display"diferencial de cDNAs. Raízes de fumo (Nicotiana tabacum) não colonizadas e colonizadas pelo fungo Glomus intraradices foram coletadas, após um período experimental de oito semanas, para a extração de RNA. Em seguida, iniciadores com base na seqüência poliadenílica do RNA mensageiro de eucariotos (oligo-dTs) foram utilizados para a síntese de cDNA. Iniciadores aleatórios ou combinações de iniciadores aleatórios e oligo-dTs foram utilizadas para amplificar, por PCR, a primeira fita de cDNA. Três produtos de amplificação presentes somente em amostras de raízes colonizadas foram identificados e clonados. Os clones foram seqüenciados e suas seqüências comparadas às seqüências de genes conhecidos. O clone NtGil apresentou 55 a 70% e 33 a 66% de identidade em nível de nucleotídeos e aminoácidos, respectivamente, com genes que codificam proteínas acessórias da urease (UreG), de várias bactérias e Arabidopsis. O clone NtGi2 também apresentou alta homologia (55 a 66% em nível de nucleotídeos e 41 a 65% em nível de aminoácidos) com proteínas UreG de várias bactérias. Esse clone é praticamente idêntico à NtGil, diferindo apenas por uma inserção de 74 nucleotídeos, entre as posições 534 e 607. A seqüência de nucleotídeos do clone NtGi3 é idêntica à sequência de NtGil, exceto pelo fato do clone NtGil abranger uma porção maior da região 3 do gene. A análise da seqüência de aminoácidos deduzida revelou a presença de sítios putativos de N-glicosilação (NYSR e NKTD), de ligação ATP/GTP (GPVGSGKT,"P-loop") e de fosforilação por quinase-tirosina (RELADYIIY). Os sítios de glicosilação e de ligação ATP/GTP são conservados entre as proteínas UreG armazenadas nos bancos de dados. No entanto, o sítio de fosforilação é específico para os cDNAs isolados. Com base nos resultados obtidos, é possível que as proteínas UreG estejam envolvidas no metabolismo do nitrogênio durante a simbiose ou ainda com a infectividade do fungo.not availabl

Analysis of the stress-inducible transcription factor SsNAC23 in sugarcane plants

Stresses such as cold and drought can impair plant yield and induce a highly complex array of responses. Sugarcane (Saccharum spp.) is cultivated in tropical and subtropical areas and is considered a cold-sensitive plant. We previously showed that cold stress induces the expression of several genes in in vitro sugarcane plantlets. Here we characterize one of those genes, SsNAC23, a member of the NAC family of plant-specific transcription factors, which are induced by low temperature and other stresses in several plant species. The expression of SsNAC23 was induced in sugarcane plants exposed to low temperatures (4ºC). With the aim of further understanding the regulatory network in response to stress, we used the yeast two-hybrid system to identify sugarcane proteins that interact with SsNAC23. Using SsNAC23 as bait, we screened a cDNA expression library of sugarcane plants submitted to 4ºC for 48 h. Several interacting partners were identified, including stress-related proteins, increasing our knowledge on how sugarcane plants respond to cold stress. One of these interacting partners, a thioredoxin h1, offers insights into the regulation of SsNAC23 activity