Separation, identification and quantitation of metabolites in biological systems by liquid chromatography and tandem mass spectrometry

Die Trennung, Identifizierung und Quantifizierung von Metaboliten in biologischen Systemen stellt eine große Herausforderung für analytisch chemische Methoden dar. Generell, macht die Analytik von Metaboliten und Biomolekülen in biologischen Proben meist eine Reduktion der hohen Probenkomplexizität nötig. Darüber hinaus bedingt die Identifizierung von Analyten im Spurenbereich auch die Einführung hoch selektiver und sensitiver Messtechniken. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) ist unter zu Hilfenahme einer breiten Anzahl an verfügbaren Selektivitätsprinzipien eine sehr vielseitige Methode zur Stofftrennung. Die Kopplung von HPLC und Massenspektrometrie (MS) stellt eine Kombination orthogonaler Selektivitäten mit sehr hoher Detektionsempfindlichkeit dar. Zielgerichtete Derivatisierungsstrategien können synergistisch eine weitere Steigerung sowohl der Selektivität, als auch der Empfindlichkeit der so erstellten Methoden zur Folge haben. Aminosäuren stellen die zentralen Analyten dieser Arbeit dar und sie wurden mit Hinblick auf eine große Breite ihrer biologischen Relevanz untersucht. Cystein wurde in seiner Funktion als Acetaldehyd-Fänger betrachtet und lieferte dabei wertvolle Informationen zum Alkoholstoffwechsel im menschlichen Körper, weiters wurde es als Biomarker für kurzfristigen Alkoholkonsum erforscht. In einem fundamentalwissenschaftlichen Ansatz wurden enantioselektive Zwitterionenaustauscher als stationäre Phasen für die HPLC untersucht. Sie wurden dabei auf präparative Trennungen von derivatisierten Aminosäureenantiomeren angewandt. Durch die Anwendung diverser LC-MS Methoden in Kombination mit selektivitäts-fördernden Deriviatisierungsstrategien konnten Spuren von D – Aminosäuren in biologischen Flüssigkeiten nachgewiesen werden. Zu diesem Zweck wurden zwei verschiedene Labelling Methoden angewendet. Die Einführung eines Metalloferrocen – Tags erlaubte die Trennung fast aller chiralen, proteinogenen Aminosäuren und erlaubte eine sehr empfindliche massenspektrometrische Detektion. In einem Ansatz diese Eigenschaften noch weiter zu verbessern, führte die Derivatisierung von Aminosäuren mit Methoxychinolin zur Trennung aller chiralen, proteinogenen Aminosäuren und einer weiteren Steigerung der MS-Empfindlichkeit, darüber hinaus wurde so eine fluoreszierende Funktionalität eingeführt, die zusätzlich HPLC mit hochempfindlicher Fluoreszenzdetektion erlaubte. Zuletzt wurde Strukturinformation über Proteine und Proteinkomplexe durch chemisches Quervernetzen gewonnen. Bei dieser Methode wurden räumlich nahe Lysin Seitenketten interagierender Proteine kovalent aneinander gebunden. In einem weiteren Schritt wurden die Proteine proteolytisch verdaut und die so gewonnen quervernetzten Peptide mit Größenausschlusschromatographie angereichert. Die nachfolgende nano-HPLC Kopplung mit hochauflösender MS stellte die ultimative Herausforderung für die Leistungfähigkeit sowohl der Chromatographie, als auch der Massenspektrometrie dar. Letztlich lieferten drei Faktoren komplementäre und essenzielle Beiträge zur Einführung von Selektivität und somit zum erfolgreichen Abschluss der Experimente: chemische Derivatisierung, chromatographische Trennung und tandem-massenspektrometrische Detektion.The separation, identification and quantitation of metabolites in biological systems poses an important, yet challenging field of application in analytical chemistry. Generally, monitoring metabolites and biomolecules in biological samples demands for a reduction of sometimes very high sample complexity. Furthermore, the identification of trace amounts of these analytical targets necessitates the introduction of highly selective and highly sensitive analytical techniques. High performance liquid chromatography (HPLC) is a powerful and versatile method for compound separations utilizing a broad range of selectivity principles. The coupling of HPLC with mass spectrometric (MS) detection combines orthogonal selectivities with very high detection sensitivity. Dedicated analyte derivatization procedures can be synergistically employed to introduce a final advance in both detection selectivity and sensitivity. Amino acids pose the central analytical targets in the present thesis and they were analysed according to a wide spectrum of their biological roles. Cysteine was investigated as an acetaldehyde scavenger to deliver valuable information on the metabolic pathways of alcohol in humans; moreover it was evaluated as a biomarker for recent ethanol consumption. In a fundamental scientific approach, new enantioselective zwitter ion exchanger chiral stationary phases for liquid chromatography were studied with respect to their ability of preparatively separating amino acid derivatives. The detection of trace amounts of D – amino acids in biological fluids was established by different HPLC-MS strategies in combination with selectivity enhancing derivatization protocols. For this reason two different labelling strategies were developed. The introduction of a metalloferrocene tag to amino acids facilitated enantioselective separation of most proteinogenic amino acids and enabled very sensitive mass spectrometric detection. In an attempt to further improve these selectivity and sensitivity promoting properties, a methoxyquinolinoyl tag was employed that allowed for the enantioseparation of all chiral proteinogenic amino acids, delivered supreme mass spectrometric detectability and moreover introduced fluorescence activity. Thereby this labelling approach additionally offered the applicability to highly sensitive LC methods with fluorescence detection. Finally, structural information of protein complexes was gathered in approaches involving the covalent crosslinking between the lysine side chains of protein regions in close proximity and consecutive proteolytic digest of the proteins. Due to a very high number of chemically similar matrix constituents, protein crosslinking experiments demanded for ultimate separation capability of liquid chromatography and pushed the performance of MS detection towards its limits. Thus, enrichment of the generated cross linked peptides via size exclusion fractionation and nano – HPLC – high resolution mass spectrometric detection were employed to deliver this analytical peak performance. Essentially, the successful outcome of the experiments was generally associated with the complementary contribution of chemical derivatization, chromatographic separation and tandem mass spectrometric detection to overall method selectivity and sensitivity

Imaging Peptide and Protein Chirality via Amino Acid Analysis by Chiral × Chiral Two-Dimensional Correlation Liquid Chromatography

The present contribution illustrates the utilization of a chiral × chiral two-dimensional liquid chromatography (2DLC) setup with <i>tert</i>-butylcarbamoyl quinine chiral stationary phase (CSP) in the first dimension (¹D) and <i>tert</i>-butylcarbamoyl quinidine CSP in the second dimension (²D) to analyze FMOC-derivatized d and l amino acids from peptide hydrolysates. Hereby, in the ¹D and ²D chiral separation dimensions factors such as selector and immobilization chemistry of the CSPs, mobile phase, temperature, column hardware dimensions, stationary phase supports, particle type and packing were identical. Orthogonality between ¹D and ²D CSPs was solely based on their stereochemistry, i.e. their opposite configurations in two chiral centers of the selector molecules, which results in inversion of enantiomer elution orders in the two dimensions. Using Coreshell CSPs for fast chromatography allowed ²D-flow rates which were 60 times faster than the ¹D-flow rates to enable online comprehensive two-dimensional chromatography (LC × LC). Due to very similar chemoselectivity, yet opposite elution orders of corresponding enantiomers in ¹D and ²D, characteristic 2D-elution patterns for achiral and chiral components can be generated. Peaks of achiral components and impurities are lined up on the diagonal line in the 2D separation space (contour plot) and thereby removed from the chromatographic space of the target enantiomers avoiding overlaps with potential interferences. Corresponding enantiomers provide cross peaks on the 2D chromatogram. Moreover, enantioselectivity of both single CSPs is combined to result in an enhanced overall 2D enantioselectivity. The concept is illustrated for the therapeutic peptides gramicidin and bacitracin. Since all amino acids give a consistent elution order as FMOC-derivatives, all enantiomers of the same configuration are either above or below the diagonal line allowing straightforward imaging of the configuration of the amino acids in peptides by the 2D chromatogram

The ALICE Transition Radiation Detector: construction, operation, and performance

The Transition Radiation Detector (TRD) was designed and built to enhance the capabilities of the ALICE detector at the Large Hadron Collider (LHC). While aimed at providing electron identification and triggering, the TRD also contributes significantly to the track reconstruction and calibration in the central barrel of ALICE. In this paper the design, construction, operation, and performance of this detector are discussed. A pion rejection factor of up to 410 is achieved at a momentum of 1 GeV/ c in p–Pb collisions and the resolution at high transverse momentum improves by about 40% when including the TRD information in track reconstruction. The triggering capability is demonstrated both for jet, light nuclei, and electron selection