Cyclooxygenases and prostaglandin E(2 )receptors in growth plate chondrocytes in vitro and in situ – prostaglandin E(2 )dependent proliferation of growth plate chondrocytes

Prostaglandin E(2 )(PGE(2)) plays an important role in bone development and metabolism. To interfere therapeutically in the PGE(2 )pathway, however, knowledge about the involved enzymes (cyclooxygenases) and receptors (PGE(2 )receptors) is essential. We therefore examined the production of PGE(2 )in cultured growth plate chondrocytes in vitro and the effects of exogenously added PGE(2 )on cell proliferation. Furthermore, we analysed the expression and spatial distribution of cyclooxygenase (COX)-1 and COX-2 and PGE(2 )receptor types EP1, EP2, EP3 and EP4 in the growth plate in situ and in vitro. PGE(2 )synthesis was determined by mass spectrometry, cell proliferation by DNA [(3)H]-thymidine incorporation, mRNA expression of cyclooxygenases and EP receptors by RT-PCR on cultured cells and in homogenized growth plates. To determine cellular expression, frozen sections of rat tibial growth plate and primary chondrocyte cultures were stained using immunohistochemistry with polyclonal antibodies directed towards COX-1, COX-2, EP1, EP2, EP3, and EP4. Cultured growth plate chondrocytes transiently secreted PGE(2 )into the culture medium. Although both enzymes were expressed in chondrocytes in vitro and in vivo, it appears that mainly COX-2 contributed to PGE(2)-dependent proliferation. Exogenously added PGE(2 )stimulated DNA synthesis in a dose-dependent fashion and gave a bell-shaped curve with a maximum at 10(-8 )M. The EP1/EP3 specific agonist sulprostone and the EP1-selective agonist ONO-D1-004 increased DNA synthesis. The effect of PGE(2 )was suppressed by ONO-8711. The expression of EP1, EP2, EP3, and EP4 receptors in situ and in vitro was observed; EP2 was homogenously expressed in all zones of the growth plate in situ, whereas EP1 expression was inhomogenous, with spared cells in the reserve zone. In cultured cells these four receptors were expressed in a subset of cells only. The most intense staining for the EP1 receptor was found in polygonal cells surrounded by matrix. Expression of receptor protein for EP3 and EP4 was observed also in rat growth plates. In cultured chrondrocytes, however, only weak expression of EP3 and EP4 receptor was detected. We suggest that in growth plate chondrocytes, COX-2 is responsible for PGE(2 )release, which stimulates cell proliferation via the EP1 receptor

Cyclooxygenase-2 expression is associated with the renal macula densa of patients with Bartter-like syndrome

Cyclooxygenase-2 expression is associated with the renal macula densa of patients with Bartter-like syndrome.BackgroundBartter-like syndrome (BLS) is a heterogeneous set of congenital tubular disorders that is associated with significant renal salt and water loss. The syndrome is also marked by increased urinary prostaglandin E2 (PGE2) excretion. In rodents, salt and volume depletion are associated with increased renal macula densa cyclooxygenase-2 (COX-2) expression. The expression of COX-2 in human macula densa has not been demonstrated. The present studies examined whether COX-2 can be detected in macula densa from children with salt-wasting BLS versus control tissues.MethodsThe intrarenal distribution of COX-2 protein and mRNA was analyzed by immunohistochemistry and in situ hybridization in 12 patients with clinically and/or genetically confirmed BLS. Renal tissue rejected for transplantation, from six adult patients not affected by BLS, was also examined.ResultsThe expression of COX-2 immunoreactive protein was observed in cells of the macula densa in 8 out 11 patients with BLS. In situ hybridization confirmed the expression of COX-2 mRNA in the macula densa in 6 out of 10 cases. COX-2 protein was also detected in the macula densa in a patient with congestive heart failure. The expression of COX-2 immunoreactive protein was not observed in cells associated with the macula densa in kidneys from patients without disorders associated with hyper-reninemia.ConclusionThese studies demonstrate that COX-2 may be detected in the macula densa of humans. Since macula densa COX-2 was detected in cases of BLS, renal COX-2 expression may be linked to volume and renin status in humans, as well as in animals

Expression of human thromboxane synthase using a baculovirus system

AbstractHuman thromboxane (TX) synthase (EC 5.3.99.5) was produced by the baculovirus expression system using cDNA encoding human TX synthase [(1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 78, 1479-1484]. A recombinant baculovirus TXS7 was expressed in Spodoptera frugiperda Sf9 insect cells. The expressed protein was recognized by monoclonal antibody, Kon 7 raised against human TX synthase [(1990) Blood 76, 80-85]. The recombinant TX synthase catalyzed the conversion of prostaglandin (PG) H2 to TXA2 and 12-hydroxy-heptadecatrienoic acid (HHT). Both conversions of PGH2 to TXA2 and HHT by the expressed TX synthase were completely inhibited by a specific TX synthase inhibitor, OKY-046 (5 μM)

Expression of human thromboxane synthase using a baculovirus system

AbstractHuman thromboxane (TX) synthase (EC 5.3.99.5) was produced by the baculovirus expression system using cDNA encoding human TX synthase [(1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 78, 1479-1484]. A recombinant baculovirus TXS7 was expressed in Spodoptera frugiperda Sf9 insect cells. The expressed protein was recognized by monoclonal antibody, Kon 7 raised against human TX synthase [(1990) Blood 76, 80-85]. The recombinant TX synthase catalyzed the conversion of prostaglandin (PG) H2 to TXA2 and 12-hydroxy-heptadecatrienoic acid (HHT). Both conversions of PGH2 to TXA2 and HHT by the expressed TX synthase were completely inhibited by a specific TX synthase inhibitor, OKY-046 (5 μM)

Bioavailability and allergoprotective capacity of milk-associated conjugated linoleic acid in a murine model of allergic airway inflammation

BACKGROUND Cross-sectional epidemiological studies have demonstrated that farm milk from traditional farm settings possesses allergoprotective properties. Up to now, it has not been clarified which milk ingredient is responsible for protection against allergic diseases. As farm milk is rich in conjugated linoleic acids (CLA), it is hypothesized that this n-3 polyunsaturated fatty acid family contributes to the allergoprotective capacity of farm milk. We aim to prove this hypothesis in a murine model of allergic airway inflammation. METHODS To prove the bioavailability and allergoprotective capacity of milk-associated CLA in a standardized protocol, milk batches that differed significantly in terms of their CLA content were spray dried and incorporated into a basic diet by substituting the regular sunflower fat fraction. Initially, the milk CLA uptake from the diet was monitored via measurement of the CLA content in plasma and erythrocyte membranes obtained from supplemented mice. To determine whether a milk CLA-enriched diet possesses allergoprotective properties, female Balb/c mice were fed the milk CLA-enriched diet ahead of sensitization and a challenge with ovalbumin (OVA) and the parameters of airway inflammation and eisosanoid pattern were measured. RESULTS In animals, supplementation with a diet rich in milk CLA resulted in elevated CLA levels in plasma and erythrocyte membranes, indicating bioavailability of milk fatty acids. Though membrane-associated phospholipid patterns were affected by supplementation with milk CLA, this application neither reduced the hallmarks of allergic airway inflammation in sensitized and OVA-challenged mice nor modified the eiconsanoid pattern in the bronchoalveolar lavage fluid of these animals. CONCLUSION Milk-associated CLA was not capable of preventing murine allergic airway inflammation in an animal model of OVA-induced allergic airway inflammation

Evidence that links loss of cyclooxygenase-2 with increased asymmetric dimethylarginine : novel explanation of cardiovascular side effects associated with anti-inflammatory drugs

© 2014 The Authors. This is an open access article under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits use, distribution, and reproduction in any medium, provided that the original work is properly cited.BACKGROUND: Cardiovascular side effects associated with cyclooxygenase-2 inhibitor drugs dominate clinical concern. Cyclooxygenase-2 is expressed in the renal medulla where inhibition causes fluid retention and increased blood pressure. However, the mechanisms linking cyclooxygenase-2 inhibition and cardiovascular events are unknown and no biomarkers have been identified.METHODS AND RESULTS: Transcriptome analysis of wild-type and cyclooxygenase-2(-/-) mouse tissues revealed 1 gene altered in the heart and aorta, but >1000 genes altered in the renal medulla, including those regulating the endogenous nitric oxide synthase inhibitors asymmetrical dimethylarginine (ADMA) and monomethyl-l-arginine. Cyclo-oxygenase-2(-/-) mice had increased plasma levels of ADMA and monomethyl-l-arginine and reduced endothelial nitric oxide responses. These genes and methylarginines were not similarly altered in mice lacking prostacyclin receptors. Wild-type mice or human volunteers taking cyclooxygenase-2 inhibitors also showed increased plasma ADMA. Endothelial nitric oxide is cardio-protective, reducing thrombosis and atherosclerosis. Consequently, increased ADMA is associated with cardiovascular disease. Thus, our study identifies ADMA as a biomarker and mechanistic bridge between renal cyclooxygenase-2 inhibition and systemic vascular dysfunction with nonsteroidal anti-inflammatory drug usage.CONCLUSIONS: We identify the endogenous endothelial nitric oxide synthase inhibitor ADMA as a biomarker and mechanistic bridge between renal cyclooxygenase-2 inhibition and systemic vascular dysfunction.Peer reviewedFinal Published versio

Characterization of the micro-environment of the testis that shapes the phenotype and function of testicular macrophages

Tissue-specific macrophages are important for the activation of innate immune responses and general organ homeostasis. Testicular macrophages (TM) reside in the testicular interstitial space and comprise the largest leukocyte population in the testis and are assumed to play a role in maintaining testicular immune privilege. Numerous studies have indicated that the interstitial fluid (IF) surrounding the TM has immunosuppressive properties, which may influence the TM phenotype. However, the identity of the immunosuppressive molecules present in the IF is poorly characterized. In this thesis it is shown that in the rat, IF shifts the M1 phenotype of granulocyte macrophage-colony stimulating factor induced bone marrow derived macrophages towards the M2 phenotype. M2 macrophages polarized by IF mimic the properties of TM such as increased expression of CD163, high secretion of IL-10 and low secretion of TNF-alpha. In addition, IF-polarized macrophages display immunoregulatory functions by inducing the expansion of immunosuppressive regulatory T cells. This thesis provides evidence that PGE2, PGI2, testosterone and corticosterone are important immunoregulatory molecules in the IF, playing a relevant role in determining the phenotype of TM. Except corticosterone, all of these factors are able to inhibit the NF-kB signaling pathway to suppress the production of pro-inflammatory cytokines and thus maintain an immunosuppressive microenvironment of the testis. Corticosterone was found to be the principal immunosuppressive molecule in the IF. Its receptor, the glucocorticoid receptor, was found to be present in TM immunohistochemically. In addition, TM locally produce small amounts of corticosterone, which suppress the expression of inflammatory genes and render TM refractory to inflammatory stimuli. Taken together, these results suggest that testicular corticosterone shapes the immunosuppressive function and phenotype of TM. This steroid hormone may therefore play also an important role in the establishment and maintenance of the immune privilege of the testis.Gewebsspezifische Makrophagen haben eine wichtige Funktion bei der Aktivierung angeborener Immunantworten und der Organhomeostase. Testikuläre Makrophagen (TM) befinden sich im Interstitium des Hodens und stellen die größte Leukozytenpopulation in der männlichen Gonade dar. Es wird angenommen, dass sie eine wichtige Funktion in der Aufrechterhaltung des Immunprivilegs des Hodens ausüben. Studien haben gezeigt, dass die interstitielle Flüssigkeit (IF), wleche die TM umgibt, immunsuppressive Eigenschaften aufweist, die den Phänotyp der TM beeinflussen könnten. Allerdings konnten immunsuppressive Moleküle in der IF bislang kaum charakterisiert werden. In der vorliegenden Arbeit wird für die Ratte als Modell gezeigt, dass die IF den durch Granulozyten- Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) induzierten M1 Phänotyp von Makrophagen, die aus dem Knochenmark isoliert wurden, in Richtung des M2 Phänotyps verschieben kann. IF-polarisierte M2-Makrophagen zeigen damit charakteristische Eigenschaften von TM, wie z. Bsp. erhöhte Expression von CD163, hohe Level von sezerniertem IL-10 bei geringer TNF-alpha Sekretion. Darüber hinaus zeigen IF-polarisierte Makrophagen immunoregulatorische Funktionen, indem sie die Expansion von immunsuppressiven regulatorischen T-Zellen induzieren. In dieser Studie werden erstmals auch Ergebnisse vorgestellt, die zeigen, dass PGE2, PGI2, Testosteron und Corticosteron wichtige immunregulatorische Moleküle in der IF darstellen und eine wesentliche Rolle bei der Bestimmung des TM-Phänotyps spielen. Mit Ausnahme von Corticosteron sind die genannten Faktoren in der Lage, den NF-kB-Signalweg zu hemmen, und damit die Produktion von entzündungshemmenden Zytokinen zu unterdrücken. Bei Corticosteron war der NFkB Signalweg bei der Immunsuppression nicht blockiert. Corticosteron konnte als wichtigster immunsuppressiver Faktor in der IF identifiziert werden. Dessen Rezeptor, der Glucocorticoidrezeptor, konnte in TM mittels Immunhistochemie gefunden werden. TM produzieren lokal moderate Mengen an Corticosteron, die die Expression inflammatorischer Gene unterdrücken und TM unempfindlich gegenüber entzündlichen Stimuli machen können. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass testikuläres Corticosteron maßgeblich für die immunsuppressive Funktion und den spezifischen Phänotyp der TM verantwortlich ist. Damit könnte das Steroidhormon auch eine wichtige Rolle bei der Etablierung und Aufrechterhaltung des Immunprivilegs im Hoden spielen

Untersuchungen zur Prostaglandinabhängigen Pathogenese des antenatalen Bartter-Syndroms am Zellmodell primär kultivierter Nierenepithelzellen

Leitsymptome des Hyperprostaglandinsyndroms sind neben einer erhöhten renalen Salz- und Wasserausscheidung eine verstärkte Reninproduktion, eine Hyperkalzurie und eine Hypertrophie des juxtaglomerulären Apparates. Bereits pränatal kommt es zur Ausbildung einer fetalen Polyurie, welche zur Ausbildung eines Polyhydramnions führen kann. Hierin ist die extrem gesteigerte Frühgeburtlichkeitsrate zwischen der 28. und 34. SSW begründet. Für die klinischen Symptome Durst, Fieber und Wachstumsbeeinträchtigungen wird v. a. eine massiv erhöhte renale Ausscheidung von PGE2 verantwortlich gemacht. In der vorliegenden Arbeit wurde anhand von primär kultivierten Schweinenierenzellen des dicken aufsteigenden Teils der Henle-Schleife, die Regulation der Prostaglandinsynthese näher untersucht und der Einfluss von Elektrolyten überprüft. Nach Stimulation mit hypotoner Lösung wurde eine Zunahme der PGE2-Synthese, der Expression der mPGES-1 mRNA und der COX-1 und COX-2 mRNA sowie eine Zunahme des Proteins der COX-2 beobachtet. Welche Art der Elektrolytveränderung hierfür ausschlaggebend ist, v. a. ob der Chloridentzug der maßgebliche Faktor ist, muss in Experimenten weiter geklärt werden. Unter isoosmolaren Bedingungen zeigte sich ebenfalls eine Expression der PGES-1, allerdings weniger deutlich als nach Stimulation mit hypoosmolarem Medium. Somit lässt sich durchaus eine Beteiligung der PGES-1 an der PGE2-Bildung bei Veränderung des zellulären Salzhaushaltes vermuten. Meine Ergebnisse geben darüber hinaus Anlass anzunehmen, dass die gesteigerte Prostaglandinsynthese MAP Kinase-gesteuert ist. Zur genaueren Aufklärung der beteiligten Faktoren und Wirkmechanismen müssen weitere Experimente erfolgen. Die klinische Relevanz weiterer Untersuchungen wird deutlich, wenn man bedenkt, dass der einzige therapeutische Ansatz der Salzverlusttubulopathien momentan die Hemmung der Prostaglandinsynthese darstellt. Es fehlen auch grundlegende Erkenntnisse über das COX-1/COX-2 Gleichgewicht im menschlichen Körper, welche für die Entwicklung weiterer Therapien notwendig sind. Mit dem Zellmodell konnten erste Regulationsmechanismen aufgedeckt werden, es eignet sich aber sicherlich auch dazu weitere Abläufe dieses Zellsystems näher zu untersuchen

Studien zur Untersuchung von F2-Isoprostanen und 8-epi-PGF2α als Marker für oxidativen Stress bei Typ 1 Diabetes

Diabetes mellitus gewinnt aufgrund steigender Fallzahlen und der dadurch bedingten Zunahme der Komplikationen, die durch die Erkrankung hervorgerufen werden, immer mehr an Bedeutung. Als ein möglicher Faktor für die Enstehung der Erkrankung und Folgeschäden wird oxidativer Stress diskutiert. Im Rahmen von oxidativem Stress verursachen freie Radikale Schäden an Proteinen, Lipiden und der DNA. Insofern wäre ein valider Marker zur Erfassung dieser Veränderungen wünschenswert. Ein bereits angewandter Parameter für die Lipidoxidation ist das MDA,das aus dem Patientenserum bestimmt wird. Daneben werden in den letzten Jahren aus dem Urin bestimmte F2-Isoprostane als zuverlässiger Marker für oxidativen Stress postuliert. Die vorliegende Arbeit besteht aus einem klinischen und einem tierexperimentellen Teil.Zunächst wurden Untersuchungen an Kindern mit Typ 1 Diabetes durchgeführt. Anschließend erfolgten ergänzend Untersuchungen an verschiedenen Mauspopulationen. Analysiert wurden dabei relevante Laborparameter wie Blutzucker, HbA1c, F2-Isoprostane, 8-epi-PGF2α und MDA. Die klinische Studie zeigt, dass sowohl MDA als auch die F2-Isoprostane bei an Typ 1 Diabetes erkrankten Kindern im Vergleich zu einer gesunden Population erhöht sind. Es kann lediglich für die F2-Isoprostane eine signifikante Korrelation zum HbA1c gefunden werden. Im Tiermodell bestätigen sich diese Ergebnisse. Darüber hinaus zeigen die Ergebnisse der tierexperimentellen Untersuchungen, dass das Fehlen des Isoenzyms COX-1 keinen Einfluss auf den Verlauf der Erkrankung hat. Das Fehlen von COX-2 führt zu einem vorzeitigen Versterben der Tiere. Der Grund dürfte in einer erhöhten Sensibilität des Pankreas für das applizierte Streptozotozin infolge des fehlenden Isoenzyms COX-2 liegen. Des Weiteren deuten die Untersuchungsergebnisse darauf hin, dass das Isoenzym COX-2 bei der Bildung des 8-epi-PGF2α eine wesentliche Rolle spielt. Für die anderen Isoprostane wird eine radikal-vermittelte Entstehung diskutiert. Unter der Gabe des Antioxidants Tempol kommt es zu einer Verminderung der Lipidoxidation (MDA, F2-Isoprostane), allerdings ohne Besserung des Blutzuckers, der Diurese und der Proteinurie. Therapieoptionen mittels Antioxidantien sollten insofern weiter diskutiert werden, da zum aktuellen Zeitpunkt die Datenlage kontrovers ist. Abschließend verbleiben aufgrund der Ergebnisse vernünftige Zweifel, ob die F2-Isoprostane als Marker für oxidativen Stress bei Typ 1 Diabetes tatsächlich aussagekräftige Ergebnisse hinsichtlich des Erkrankungsausmaßes liefern

Differentielle Proteinexpression in Nierenepithelzellen unter hypoosmolaren Kulturbedingungen

Salzverlust-Tubulopathien, wie das antenatale Bartter-Syndrom, werden durch spezifische epitheliale Ionentransportdefekte hervorgerufen. Als primäre Ursache für das antenatale Bartter-Syndrom, auch Tubulopathie des Furosemid-Typs (FSLT) genannt, wird eine gestörte Chloridresorption im Bereich des dicken aufsteigenden Schenkels der Henle-Schleife verantwortlich gemacht. Ziel dieser Arbeit ist es molekulare Veränderungen hervorgerufen durch intrazelluläre Elektrolytveränderungen an einem Zellmodell zu untersuchen. Als zelluläres Modell dienten primär kultivierte Nierenepithelzellen isoliert aus der renalen Medulla der Schweineniere. Bei Patienten, die am antenatalen Barttersyndrom erkrankt sind, erfolgt z. B. durch den Funktionsverlust des Na/K/2Cl-Kotransporters NKCC2, eine intrazelluläre Verarmung an Na und Cl. Diese pathologische Situation wurde am Zellmodell durch Veränderung des extrazellulären Milieus simuliert. Hierbei bewirkt die Inkubation der Epithelzellen in hypoosmolarem Medium eine intrazelluläre Salzverarmung. Vorrangiges Ziel war es, die unter diesen Bedingungen entstandenen Veränderungen in der Proteinexpression aufzudecken, zu identifizieren und in Beziehung zu den ablaufenden Zellreaktionen zu bringen. Mittels der 2-Dimensionalen Gelelektrophorese gekoppelt mit einer hochsensitiven Silberfärbung wurde die Proteinexpression der Nierenepithelzellkultur untersucht. Differentiell exprimierte Proteine wurden durch ein entsprechendes Bearbeitungsprogramm aufgedeckt und durch die massenspektrometrischen Bestimmung und der Analyse mittels Peptide-Mass-Fingerprint identifiziert. Dabei zeigte sich unter der Behandlung mit hypoosmolarer Lösung eine Intensitätsverändung der Proteine Vimentin und Cytokeratin 8. Bei diesen Proteinen handelt es sich um intermediäre Filamente, die Bestandteile des Zytoskeletts sind. Die identifizierten Peptide der beiden Proteine zeigten eine besonders hohe Homologie zu den in der Datenbank NCBI abgelegten Sequenzen der Spezies Cricetulus griseus (Acession Number:gi/ 860908) für Vimentin und der Spezies Bos taurus (Acession Number:gi/ 125109) für Cytokeratin. Verglichen mit der Kontrollgruppe ergab sich in der behandelten Gruppe eine Zunahme der Proteinintensität des Proteins Vimentin um das 12fache. Bei Cytokeratin 8 zeigte sich eine Verdopplung der Proteinintensität. Weiterhin wurden durch Western Blot-Untersuchungen mittels spezifischer Antikörper gerichtet gegen Vimentin und Cytkeratin 8, die veränderte Proteinexpression im 1D-Gel verifiziert. Zusammenfassend zeigen diese Untersuchungen, dass Nierenepithelzellen unter hypoosmolaren Bedingungen mit einer veränderten Zellexpression reagieren. Inwiefern diese auch auf die beim antenatalen Barttersyndrom vorliegende zelluläre Situation übertragen werden kann, müssen weiterführende Studien klären