Somatic mosaic mutation in TNFRSF1A as a cause of Tumor necrosis factor receptor-associated periodic syndrome- Impact on genetic counselling

Introduction: Tumor necrosis factor (TNF) receptor-associated periodic syndrome (TRAPS) is a rare monogenic systemic autoinflammatory disease caused mainly by germline heterozygous missense mutations in exons 2-4 of the TNF receptor super family member 1A (TNFRSF1A) gene. TRAPS is known as a familial disorder of autosomal dominant inheritance. Objective: To identify the genetic defect underlying the disease in a patient with a phenotype evocative of TRAPS. Methods: (i) The patient’s DNA was analyzed by Sanger sequencing of TNFRSF1A exons 2-4 followed by a NGS approach based on the targeted sequencing of the main genes involved in systemic autoinflammatory disorders; and (ii) Subpopulations of peripheral blood cells were subsequently analyzed in order to study the cellular distribution of the identified molecular defect.Results: (i) Clinical phenotype: A 36-year-old man presented since the age of 24 with recurrent episodes of fever (38-40C°) lasting for 1-2 weeks. The febrile attacks were accompanied with severe abdominal, thoracic and lower back pain, myalgia, and transitory erythematous eruptions localized at elbows and left lower limb. He also had an acute episode of pericarditis. No lymphadenopathy, ophthalmological or neurological symptoms were observed. Laboratory tests showed elevated inflammatory biological markers: increased serum levels of CRP (171 mg/l) with hyperleukocytosis (15000/l). Serum ferritin levels and kidney function tests were normal. (ii) Molecular bases: No heterozygous mutation was identified after Sanger sequencing of exons 2-4 of TNFRSF1A. The patient’s phenotype, highly evocative of TRAPS, prompted us to deepen the molecular investigations through the use of our autoinflammatory disorders NGS panel. We identified the c.176G>A p.(Cys59Tyr) TNFRSF1A mutation in a mosaic state with 14% of mutated allele in whole blood. This mutation (also known as C30Y) has already been reported, but in the heterozygous state, in three TRAPS families. We further studied the distribution of the mutated alleles in blood cells and observed a higher percentage of the mutated allele in myeloid cells (i.e. 15.8% in monocytes and 14.1% in neutrophils) than in lymphoid cells (i.e., 9.6% in T cells and 8.9% in B cells). Discussion: So far, only 3 other patients have been reported with a somatic mutation in TNFRSF1A. Among them, one displayed a germinal mosaicism. In our patient, the mosaicism predominantly involved the myeloid lineage (involved in the pathophysiology of TRAPS). In the 4 patients now identified with a TNFRSF1A somatic mosaic mutation, the phenotypic severity of TRAPS appears not to be related to the germinal/mosaic status of TNFRSF1A mutations.Conclusion: Somatic mosaic TNFRSF1A mutations should be sought in sporadic cases of TRAPS with no mutation identified by Sanger sequencing. Genetic counseling should take into account the fact that somatic mosaic mutations are not restricted to myeloid cells and may be present in other cell lineages

Mosaic variants in TNFRSF1A : an emerging cause of tumour necrosis factor receptor-associated periodic syndrome

International audienceObjective To identify the molecular basis of a systemic autoinflammatory disorder (SAID) evocative of TNF receptor-associated periodic syndrome (TRAPS). Methods (i) Deep next generation sequencing (NGS) through a SAID gene panel; (ii) variant allele distribution in peripheral blood subpopulations; (iii) in silico analyses of mosaic variants using TNF receptor superfamily 1A (TNFRSF1A) crystal structure; (iv) review of the very rare TNFRSF1A mosaic variants reported previously. Results In a 36-year-old man suffering from recurrent fever for 12 years, high-depth NGS revealed a TNFRSF1A mosaic variant, c.176G>A p.(Cys59Tyr), which Sanger sequencing failed to detect. This mosaic variant displayed a variant allele fraction of 14% in whole blood; it affects both myeloid and lymphoid lineages. p.(Cys59Tyr), a recurrent germline pathogenic variant, affects a crucial cysteine located in the first cysteine-rich domain (CRD1) and involved in a disulphide bridge. Introduction of a tyrosine at this position is expected to disrupt the CRD1 structure. Review of the three previously reported TNFRSF1A mosaic variants revealed that they are all located in a small region of CRD2 and that germinal cells can be affected. Conclusion This study expands the localization of TNFRSF1A mosaic variants to the CRD1 domain. Noticeably, residues involved in germline TNFRSF1A mutational hot spots can also be involved in post-zygotic mutational events. Including our study, only four patients have been thus far reported with TNFRSF1A mosaicism, highlighting the need for a high-depth NGS-based approach to avoid the misdiagnosis of TRAPS. Genetic counselling has to consider the potential occurrence of TNFRSF1A mosaic variants in germinal cells

Autoinflammation liée à l’haploinsuffisance A20 : identification et caractérisation fonctionnelle de nouveaux variants A20

A20 est une enzyme d'édition de l'ubiquitine codée par le gène A20 (ou TNFAIP3, tumor necrosis factor a-induced portien 3). A travers son activité E3 ligase et déubiquitinase, A20 régule plusieurs substrats de la voie NF-kappaB, tels que RIP1, NEMO et TRAF6. La protéine A20 joue un rôle central dans la régulation de l'inflammation et de l'immunité en inhibant cette voie de signalisation. Les premières mutations d’A20 décrites en 2016 conduisaient à une haploinsuffisance, donnant ainsi le nom haploinsuffisance A20 (HA20) à cette maladie auto-inflammatoire (MAI) de transmission autosomique dominante. Le phénotype de HA20 est partiellement chevauchant avec celui de la maladie de Behçet mais se caractérise par un âge de début de maladie précoce ; il associe des accès récurrents de fièvre, des ulcères buccaux et génitaux, une atteinte gastro-intestinale avec diarrhée, des arthralgies ou polyarthrites et des uvéites antérieures bilatérales. Avec plus de 25 mutations tronquantes de A20 rapportées à ce jour, HA20 est une MAI monogénique fréquemment diagnostiquée. Cependant, la signification pathogénique des variations faux-sens de A20 a été peu étudiée est reste difficile à établir. Dans cette étude, nous avons identifié chez six patients indépendants présentant une MAI, cinq nouvelles variations de A20 dont le retentissement fonctionnel a été évalué par des tests cellulaires in vitro : deux variations responsables d’un décalage de cadre de lecture et trois faux-sens. Les deux variations tronquantes c.716dup (p.Ala240Cysfs*14) et c.1504del (p.Arg502Glyfs*195), entraînent une haploinsuffisance due à une dégradation des transcrits A20 par non-sens mRNA decay. La variation faux-sens c.707T>C (p.Leu236Pro) (de classe 3 selon les recommandations de l’American College of Medical Genetics), est responsable d’une dégradation accrue de la protéine mutée (suivi de la stabilité de la protéine et de la dégradation par le protéasome). La baisse d’expression de la protéine A20-Leu236Pro a été par ailleurs confirmée dans les PBMCs provenant des patients. En plus du défaut d’expression, la protéine A20-Leu236Pro présente un défaut fonctionnel avec une moindre suppression de l'activité NF-kappaB que la protéine A20 normale. Quant aux deux autres variations faux-sens identifiées : c.464C>T (p.Thr155Met) et c.237C>G (p.Ser79Arg), de classe 3 également, elles n’étaient responsables d’aucune anomalie dans les tests in vitro utilisés (étude de l’expression de la protéine et de l’activité NF-kappaB). Au total, cette étude souligne l’importance d’évaluer le retentissement fonctionnel des variations faux-sens identifiées dans le gène A20 chez les patients chez qui un diagnostic de HA20 est suspecté : les résultats de ces analyses conditionnent la prise en charge thérapeutique des patients et le conseil génétique

A critical region of A20 unveiled by missense TNFAIP3 variations that lead to autoinflammation

International audienceA20 haploinsufficiency (HA20) is an autoinflammatory disease caused by heterozygous loss-of-function variations in TNFAIP3 , the gene encoding the A20 protein. Diagnosis of HA20 is challenging due to its heterogeneous clinical presentation and the lack of pathognomonic symptoms. While the pathogenic effect of TNFAIP3 truncating variations is clearly established, that of missense variations is difficult to determine. Herein, we identified a novel TNFAIP3 variation, p.(Leu236Pro), located in the A20 ovarian tumor (OTU) domain and demonstrated its pathogenicity. In the patients’ primary cells, we observed reduced A20 levels. Protein destabilization was predicted in silico for A20_Leu236Pro and enhanced proteasomal degradation was confirmed in vitro through a flow cytometry-based functional assay. By applying this approach to the study of another missense variant, A20_Leu275Pro, for which no functional characterization has been performed to date, we showed that this variant also undergoes enhanced proteasomal degradation. Moreover, we showed a disrupted ability of A20_Leu236Pro to inhibit the NF-κB pathway and to deubiquitinate its substrate TRAF6. Structural modeling revealed that two residues involved in OTU pathogenic missense variations (i.e. Glu192Lys and Cys243Tyr) establish common interactions with Leu236. Interpretation of newly identified missense variations is challenging, requiring, as illustrated here, functional demonstration of their pathogenicity. Together with functional studies, in silico structure analysis is a valuable approach that allowed us (i) to provide a mechanistic explanation for the haploinsufficiency resulting from missense variations and (ii) to unveil a region within the OTU domain critical for A20 function

Autoinflammatory Diseases: Germline vs. Somatic Mosaic Variations

National audienceDuring the period of 2018-2023, we have identified 10 pathogenic variations in the NLRP3 gene (Figure 1) including:-8 different mosaic variations in 11 independent patients-2 different germline variations in 3 independent patients. A total of 34 mosaic and 88 germline NLRP3 variations have been reported in the literature to date (Figure 1). Clinically, NLRP3 mosaic variations are associated with various NLRP3-AID phenotypes ranging from late-onset urticaria in the context of MWS to CINCA. Conclusions This study emphasizes the high frequency of somatic mosaic variations in NLRP3-AIDs. The phenotypic spectrum of NLRP3-AIDs appears to be related to both the germinal/mosaic status and the localization in cryopyrin of the underlying variations. Mosaic variations in the NLRP3, TNFRSF1A, and NLRC4 genes can cause symptoms even when present at very low allele frequencies (below 5%). Furthermore, misdiagnosis may occur due to the low allele frequency of mosaic variations

Autoinflammation liée à l’haploinsuffisance A20 : identification et caractérisation fonctionnelle de nouveaux variants A20

A20 est une enzyme d'édition de l'ubiquitine codée par le gène A20 (ou TNFAIP3, tumor necrosis factor a-induced portien 3). A travers son activité E3 ligase et déubiquitinase, A20 régule plusieurs substrats de la voie NF-kappaB, tels que RIP1, NEMO et TRAF6. La protéine A20 joue un rôle central dans la régulation de l'inflammation et de l'immunité en inhibant cette voie de signalisation. Les premières mutations d’A20 décrites en 2016 conduisaient à une haploinsuffisance, donnant ainsi le nom haploinsuffisance A20 (HA20) à cette maladie auto-inflammatoire (MAI) de transmission autosomique dominante. Le phénotype de HA20 est partiellement chevauchant avec celui de la maladie de Behçet mais se caractérise par un âge de début de maladie précoce ; il associe des accès récurrents de fièvre, des ulcères buccaux et génitaux, une atteinte gastro-intestinale avec diarrhée, des arthralgies ou polyarthrites et des uvéites antérieures bilatérales. Avec plus de 25 mutations tronquantes de A20 rapportées à ce jour, HA20 est une MAI monogénique fréquemment diagnostiquée. Cependant, la signification pathogénique des variations faux-sens de A20 a été peu étudiée est reste difficile à établir. Dans cette étude, nous avons identifié chez six patients indépendants présentant une MAI, cinq nouvelles variations de A20 dont le retentissement fonctionnel a été évalué par des tests cellulaires in vitro : deux variations responsables d’un décalage de cadre de lecture et trois faux-sens. Les deux variations tronquantes c.716dup (p.Ala240Cysfs*14) et c.1504del (p.Arg502Glyfs*195), entraînent une haploinsuffisance due à une dégradation des transcrits A20 par non-sens mRNA decay. La variation faux-sens c.707T>C (p.Leu236Pro) (de classe 3 selon les recommandations de l’American College of Medical Genetics), est responsable d’une dégradation accrue de la protéine mutée (suivi de la stabilité de la protéine et de la dégradation par le protéasome). La baisse d’expression de la protéine A20-Leu236Pro a été par ailleurs confirmée dans les PBMCs provenant des patients. En plus du défaut d’expression, la protéine A20-Leu236Pro présente un défaut fonctionnel avec une moindre suppression de l'activité NF-kappaB que la protéine A20 normale. Quant aux deux autres variations faux-sens identifiées : c.464C>T (p.Thr155Met) et c.237C>G (p.Ser79Arg), de classe 3 également, elles n’étaient responsables d’aucune anomalie dans les tests in vitro utilisés (étude de l’expression de la protéine et de l’activité NF-kappaB). Au total, cette étude souligne l’importance d’évaluer le retentissement fonctionnel des variations faux-sens identifiées dans le gène A20 chez les patients chez qui un diagnostic de HA20 est suspecté : les résultats de ces analyses conditionnent la prise en charge thérapeutique des patients et le conseil génétique

Molecular screening of a large cohort of Moroccan patients with congenital hypopituitarism

Background/ObjectivesCongenital hypopituitarism is a raredisease which, for most patients, has no identified molecularcause. We aimed to document the molecular basis of growthretardation in a Moroccan cohort.Design/Patients80 index cases [54 with isolated growth hor-mone deficiency (IGHD), 26 with combined pituitary hormonedeficiency (CPHD)] were screened for molecular defects inGH1(includingLCR-GH1),GHRHR,GHSR,GHRH,PROP1,POU1F1,HESX1,LHX3,LHX4andSOX3.ResultsFive different deleterious mutations were identified in14 patients from eight families. In the IGHD group, three geneswere found to be involved:GH1,GHRHRandGHSR. In theCPHD group,PROP1was the only mutated gene. In addition,two heterozygous variations whose deleterious effect remains tobe demonstrated were identified (inGH1andLHX4), and twopolymorphisms (missense variations) were detected (inLHX3and inGHSR). The prevalence of mutations in this MoroccanGHD cohort was 10% (8/80), 111% (6/54) in the IGHD groupand 77% (2/26) in the CPHD group.ConclusionThis is the first molecular screening of congenitalGHD in a Moroccan population and, like other studies, muta-tions were preferentially identified in familial cases (75%); muta-tions in genes such asPOU1F1,HESX1,SOX3,LHX3andLHX4are extremely rare. The p.R73CPROP1mutation was the mostfrequent mutation in CPHD; this should be the first one toscreen in this population. Our results should contribute to abetter diagnosis and management of this heterogeneous diseaseconditio

Expression tardive d’une maladie autoinflammatoire : identification et caractérisation fonctionnelle d’une variation de NLRC4 en mosaïque

National audienceIncreased plasma levels of the pro-inflammatory cytokines IL1β, TNFα, IL6 and IL18 during flares, with sustained elevated levels of IL18 during patient's remission The p.Thr133Ile NLRC4 variation induced increased inflammasome activation The p.Thr133Ile NLRC4 variant activated the NFκB pathway Clinical Features The patient is a 28-year-old man with a chronic psychosis since the age of 18 who has been experiencing: Conclusion In this study, we identified a novel mosaic variation of NLRC4 in an adult patient with an autoinflammatory disease. Functional studies demonstrated the gain-of-function pathogenic effect of the identified variation on inflammation. NLRC4 acts as an adaptor protein that is recruited by NAIP to initiate the formation of the NLRC4-NAIP inflammasome upon recognition of bacterial elements. The NLRC4-NAIP inflammasome requires the adaptor protein ASC (apoptotic speck protein containing a CARD) to recruit the caspase-1 protease, which cleaves the pro-interleukins (pro-IL1b and pro-IL18), resulting in the production of their active forms (IL1b and IL18) and triggering the inflammatory response.Introduction. Les maladies autoinflammatoires (MAI) débutent en règle dans l'enfance par des crises fébriles spontanément résolutives, accompagnées d'une inflammation de la peau, des séreuses et des synoviales. Les mécanismes physiopathologiques touchent les facteurs de l'immunité innée, tels que les inflammasomes qui sont des complexes multiprotéiques impliqués dans l'activation des voies de l’inflammation. NLRC4, qui code pour un composant essentiel de l’inflammasome NLRC4, a été impliqué dans des formes très rares et sévères de MAI survenant majoritairement chez l’enfant et caractérisées le plus souvent par une entérocolite et pouvant se compliquer d’un syndrome d’activation macrophagique (SAM). Seules 2 variations en mosaïque ont été rapportées chez des patients adultes. L’objectif de cette étude était d’identifier les bases moléculaires d’une MAI ayant débuté à l’âge adulte par des crises inflammatoires sévères associant une fièvre élevée et des douleursarticulaires et abdominales sans syndrome d’activation macrophagique.Méthodes. L’ADN génomique leucocytaire du patient a été analysé par le séquençage (NGS) profond (1100 X) d’un panel de gènes de MAI. L’évaluation fonctionnelle de la variation identifiée dans NLRC4 a été réalisée après expression de la protéine recombinante correspondante dans une lignée HEK293T exprimant différent partenaires protéiques (ASC et Caspase1) permettant la détection d’agrégats (« specks ») témoins de l’activation de l’inflammasome NLRC4, et transfectée par un gène rapporteur de la voie NF-kB. Les taux plasmatiques de cytokines pro-inflammatoires ont été déterminés par ELISA.Résultats. Le patient, un jeune homme de 23 ans, présentait une psychose non étiquetée depuis l’âge de 19 ans. Depuis ses 21 ans, des crises inflammatoires sévères sont rapportées sans qu’un lien direct entre la maladie psychiatrique et les crises inflammatoires n’ait pu être établi. L’étude NGS par séquençage profond a montré l’existence d’une variation en mosaïque de NLRC4, c.398C>T p.(Thr133Ile), l’allèle muté étant représenté à 5% au sein de l’ADN leucocytaire. L’étude de l’impact de la variation p.(Thr133Ile) sur la voie NF-kB a révélé une augmentation significative de l'activité NF-kB dans les cellules exprimant la forme mutée de la protéine par rapport à celles exprimant la forme sauvage. Comparée à l’impact de la version normale de NLRC4 sur la formation de specks, la variationp.(Thre133Ile) induit une augmentation du nombre de specks. Par ailleurs, la quantification des cytokines pro-inflammatoires a montré des taux plasmatiques élevés de IL18 compatibles avec une activation de l’inflammasome NLRC4.Conclusion. Cette étude a permis d’identifier une nouvelle variation de NLRC4 en mosaïques’exprimant à l’âge adulte, sans syndrome d’activation macrophagique, et dont l’effet pathogène gain de fonction a été démontré par des études fonctionnelles sur deux voies de l’inflammation

Identification et caractérisation fonctionnelle de mutations de lyn dans une urticaire auto-inflammatoire syndromique

International audienceLes Maladies auto-inflammatoires (MAI) sont liées à des anomalies génétiques de facteurs impliqués dans le système immunitaire et caractérisées par des accès inflammatoires fébriles récurrents spontanément résolutifs. LYN code pour une protéine tyrosine kinase, dont l’activation est régulée par l’état de phosphorylation de 2 de ses tyrosines (Y397 et Y508). Dans un modèle murin, le knock-in Y508F conduit à une hyperactivation de Lyn et au développement d’une glomérulonéphrite autoimmune sévère. A ce jour, 2 patients avec une MAI sévère de début néonatal et présentant chacun une variation de novo du dernier exon de LYN (Y508* et Y508F), non explorées sur le plan fonctionnel, ont été rapportés lors de conférences spécialisées. MethodesEtude NGS d’un panel de gènes de MAI chez une patiente présentant une forme néonatale sévère de MAI. Etudes fonctionnelles in vitro des variations LYN : étude de la phosphorylation de Lyn par western blot et activation de la voie NF-kB par essai luciférase dans la lignée HEK293T. ConclusionIl s’agit de la 1ère démonstration de la pathogénicité des 3 variations de LYN rapportées chez l’homme à ce jour, et ce par effet gain-de-fonction.Les 3 variations (Y508H, Y508F et Y508*) affectent le même résidu Tyrosine de la protéine, soulignant le rôle critique de cet acide aminé dans la régulation de l’activité de Lyn.L’analyse fine du phénotype de ce patient et sa comparaison avec le phénotype des 2 précédents patients rapportés permet de définir un spectre phénotypique de cette MAI associée à des variations gain-de-fonction de LYN

De novo gain‐of‐function variations in LYN lead to an early onset systemic autoinflammatory disorder

International audienceObjective: To identify the molecular basis of a severe systemic autoinflammatory disorder (SAID) and define its main phenotypical features. To functionally assess the sequence variations identified in LYN, a gene encoding a non-receptor tyrosine-kinase.Methods: (i) Targeted next-generation sequencing; (ii) In vitro functional studies of Lyn phosphorylation state and of Lyn-dependent NF-κB activity after expression of recombinant Lyn isoforms carrying different sequence variations.Results: We identified a de novo LYN variation (p.Tyr508His) in a patient presenting since birth with recurrent fever, chronic urticaria, atopic dermatitis, arthralgia, increased inflammatory biomarkers and elevated plasma cytokine levels. We studied the consequences on Lyn phosphorylation state of the Tyr508His variation and of the two LYN variations reported so far (p.Tyr508Phe and p.Tyr508*), and showed that all three variations prevent phosphorylation of residue 508 and lead to autophosphorylation of Tyr397. Additionally, these three LYN variations activate the NF-κB pathway. These results reflect a gain-of-function effect of the variations involving Tyr508 on Lyn activity.Conclusions: This study, which demonstrates the pathogenicity of the first three LYN variations identified in SAID patients, delineates the phenotypic spectrum of a disease entity characterized by an early onset severe inflammatory disease affecting neonates with no family history of SAID. All three variations affect the same tyrosine residue located in the C-terminus of Lyn, thereby underlining the critical role of this residue in the proper regulation of Lyn activity in humans