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Poder discriminatório das tecnicas de RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) e PFGE (Pulsed-field gel electrophoresis) para diferenciar Campylobacter jejuni isoladas de carcaças de frangos
Campylobacter jejuni is recognized as the main agent that causes foodborne gastroenteritis in the US and Europe. Chicken meat is the main vehicle of transmition of disease to humans. One of the ways to epidemiologically evaluate the microorganism are the genotyping techniques such as PFGE and RAPD. However, there are few studies comparing techniques in terms of discrimination efficiency of the strains. The aim of this study was to evaluate the genetic similarity of 44 strains of C. jejuni isolated from carcasses of broiler chickens under system of federal inspection (SFI). The isolated samples were genotyped by the PFGE methods using the SmaI enzyme and RAPD using primers 1290 and HLWL, alone and combined, for the subsequent photodocumentation for computational analysis, totalizing four dendrograms. The analyzes of the dendrograms formed were based on the comparison of the different profiles, pulses/clusters and clones formed. The results showed that eight distinct profiles and only one cluste/pulsetype in common were identified for the four tests. The other strains showed totally different behavior, making it difficult to compare RAPD and PFGE. In addition, it became clear that primer 1290 does not show good discriminatory power, proving the need to use more than one primer in this technique. In general, the RAPD presented greater discriminatory power, but it is worth considering that the technique has low reproducibility and that PFGE is widely recognized as a gold standard.Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação)Campylobacter jejuni é reconhecido como principal agente causador de gastroenterite de origem alimentar nos EUA e na Europa. A carne de frango representa o principal veículo de transmissão da doença aos humanos. Uma das maneiras de avaliar epidemiologicamente o micro-organismo são as técnicas de genotipagem como o PFGE e o RAPD, porém são poucos os estudos que comparam as técnicas em relação à eficiência na discriminação das cepas. Objetivou-se avaliar a similaridade genética de 44 cepas de C. jejuni isoladas de carcaças de frangos de estabelecimento sob sistema de inspeção federal (SIF). As amostras isoladas foram genotipadas pelos métodos PFGE utilizando a enzima SmaI e RAPD utilizando os primers 1290 e HLWL, isoladamente e em conjunto, para a posterior fotodocumentação para análise computacional, totalizando quatro dendrogramas. As análises dos dendrogramas formados basearam-se na comparação dos perfis distintos, clusters e clones formados. Os resultados obtidos mostraram que foram identificados oito perfis distintos e apenas um cluster/pulsotipo em comum para os quatro testes. As demais cepas apresentaram comportamento totalmente diferenciado, tornando difícil a comparação entre RAPD e PFGE. Além disso, ficou evidente que o primer 1290 não apresenta bom poder discriminatório, comprovando a necessidade de utilização de mais de um primer nessa técnica. De maneira geral, o RAPD apresentou maior poder discriminatório, porém vale considerar que a técnica apresenta baixa reprodutibilidade e que o PFGE é amplamente reconhecido como padrão-ouro
Multivirulência e disseminação fenotípica de Campylobacter jejuni veiculadas pela carne de frangos no Brasil
Campylobacter is among the four pathogens most incriminated in foodborne diarrheal diseases worldwide and C. jejuni is the most involved species in campylobacteriosis. Among the sources of illness to humans, the consumption of undercooked chicken meat has been highlighted, and for this reason, in addition to public health, there is also an impact on the economy. The dissertation was divided into two chapters. The first one describes the general considerations, reporting relevant information to the reader's context on the proposed theme, and also the general and specific aims of the study. The second chapter records the epidemiological study of 359 strains of C. jejuni isolated from 114 chilled chicken carcasses, slaughtered in establishments registered under federal inspection, and qualified for internal and external trade between the years 2017 and 2018. The isolations were performed in an official laboratory of the Ministry of Agriculture, Livestock and Supply using the methodology proposed by ISO 10272-1: 2017 (ISO, 2017) for the genus and the mass spectrometer (MALDI TOF®) for the identification of the species. The strains were evaluated by conventional PCR for a panel of 14 virulence genes categorized as: i) biofilm formation - flaA (motility) and luxS (quorum-sensing mechanism); ii) secretion systems - cdtABC (distensive cytotoxin secretion) and hcp (type VI secretion system; iii) invasion and colonization - cadF (intracellular colonization), ciaB (cell invasion) and pldA (invasion/colonization); iv) adaptation to stress - dnaJ (thermotolerance), htrA (aid in growth under stress) and cbrA (resistance to osmotic shock); and v) induction of Guillain-Barré Syndrome - cstII (SGB) and neuA (SGB). The results were used to create profiles, determine the variability, virulence, and multivirulence indexes of the strains. The spectra obtained in the identification of the species by mass spectrometry, were used for the construction of a dendrogram, to evaluate the distribution of the strains.Dissertação (Mestrado)Campylobacter está entre os quatro patógenos mais incriminados em doenças diarréicas de origem alimentar em todo o mundo e C. jejuni é a espécie mais envolvida na campilobacteriose. Dentre as fontes da enfermidade aos humanos, o consumo da carne de frango mal cozida tem merecido destaque, e por isso, além da saúde pública, também há impacto na economia. A dissertação foi dividida em dois capítulos. O primeiro capítulo descreve as considerações gerais, relatando informações relevantes para a contextualização do leitor sobre o tema proposto, os objetivos gerais e os específicos. O segundo capítulo, registra o estudo epidemiológico de 359 cepas de C. jejuni isoladas de 114 carcaças de frango resfriadas, abatidas em estabelecimentos registrados sob inspeção federal e habilitados para o comércio interno e externo entre os anos de 2017 e 2018. Os isolamentos foram realizados em laboratório oficial do Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento utilizando a metodologia proposta pela ISO 10272-1:2017 (ISO, 2017) para o gênero e o espectrômetro de massa (MALDI TOF®) para a identificação da espécie. As cepas foram avaliadas por PCR convencional para um painel de 14 genes de virulência categorizados como: i) formação de biofilmes - flaA (motilidade) e luxS (mecanismo quórum -sensing); ii) sistemas de secreção - cdtABC (secreção de citotoxina distensiva) e hcp (sistema de secreção tipo VI; iii) invasão e colonização - cadF (colonização intracelular), ciaB (invasão celular) e pldA (invasão/colonização); iv) adaptação ao estresse - dnaJ (termotolerância), htrA (auxílio no crescimento sob estresse) e cbrA (resistência ao choque osmótico); e v) indução à Síndrome de Guillain-Barré - cstII (SGB) e neuA (SGB). Os resultados foram utilizados para criar perfis, determinar os índices de variabilidade, virulência e multivirulência das cepas. O georreferenciamento identificou zonas quentes de isolamento, virulência e multivirulencia. Os espectros obtidos na identificação das espécies pela espectrometria de massa, foram utilizados para a construção de um dendrograma, para avaliar a distribuição das cepas
Campylobacter spp. isolados de fezes de suínos submetidos a estresse de transporte: espécies e resistência antimicrobiana
Avaliou-se a influência do estresse de transporte na presença de Campylobacter spp. em fezes suínas de 60 animais sua resistência aos antimicrobianos. As coletas foram realizadas na granja de terminação e após o transporte ao abatedouro, totalizando 120 amostras. O isolamento foi realizado pelo cultivo em placa e a identificação das espécies obtida por testes bioquímicos e PCR. Campylobacter spp. foi isolado de 63,3% das amostras coletadas na granja e 91,6% no abatedouro, evidenciando a influência do estresse de transporte no aumento da isolamentos (P<0,05). Foram identificadas as espécies C. coli biótipo I, C. jejuni biótipo I e C. jejuni subsp. doylei, sendo que C. coli foi mais prevalente na granja e C. jejuni no abatedouro. Foi observada resistência bacteriana para todas as seis classes de antibióticos testados. Dentre estes, os isolados apresentaram maior resistência à lincomicina, tetraciclina e ácido nalidíxico (98,9%), e maior sensibilidade à amoxacilina (22,5%). As cepas de C. coli apresentaram maior resistência antimicrobiana que as de C. jejuni (P<0,05). Os resultados deste estudo alertam para os altos índices de isolamento de C. coli e C. jejuni em fezes de suínos destinados ao abate e possíveis riscos relacionados ao consumo da carne. Os altos padrões de resistência atentam para o risco à saúde pública
First Report of Genetic Variability of Erysipelothrix sp. Strain 2 in Turkeys Associated to Vero Cells Morphometric Alteration
Erysipelas is a disease caused by the Erysipelothrix genus, whose main species is the E. rhusiopathiae, the causative agent of animal erysipelas and human erysipeloid. We isolated Erysipelothrix sp. strain 2 (ES2) from turkey’s organs during an outbreak in Brazilian commercial and breeder flocks with sepsis and high mortality levels. We studied 18 flocks, accounting for 182 samples, being eight flocks (84 samples) as ES2 positive with individuals demonstrating clinical symptoms and high mortality. We obtained the genetic variability of 19 samples with PFGE and found two clones, both from the same flock but different samples, and two clusters. Interestingly, we found 15 strains with high genetic variability among and within flocks. We have found a positive association between the proximity of ES2 positive turkey flocks and commercial swine sites through epidemiological analysis. We infected Vero cells with two different isolates and three distinct concentrations of ES2. After performing the morphometry, we recorded enlargement of the nucleus and nucleolus. Moreover, we performed fluorescence assays that resulted in apoptotic and necrotic cells. We demonstrated that ES2 could multiply in the extracellular medium and invade and survive inside Vero cells. For the first time, our finds show that ES2 may have similar behavior as E. rhusiopathiae as a facultative intracellular microorganism, which may represent a hazard for humans