Pharmacology of Cav1.2 and Cav1.3 L-type Ca2+ channels : implications for the treatment of human brain disorders

Spannungsabhängige L-Typ Ca2+-Kanäle (LTCK) ermöglichen zellulären Ca2+-Einstrom in Reaktion auf Membrandepolarisationen und regulieren dadurch viele Körperfunktionen wie Muskelkontraktion, endokrine Sekretion oder Ca2+-abhängige Gen-Transkription. Es gibt akkumulierende Hinweise für eine Beteiligung von LTCK Bei Hirnerkrankungen. In meiner Arbeit habe ich die pharmakologische Modulation der beiden Gehirn-LTCK Isoformen, Cav1.2 und Cav1.3, sowie deren Implikation bei Parkinson und neuropsychiatrischen Erkrankungen untersucht. Ca2+-Kanalblocker (CKB) wie Antihypertensiva der Dihydropyridin (DHP)-Familie sind seit Jahrzehnten verfügbar, jedoch ist ihre Dosierung aufgrund des bevorzugten Blocks von Cav1.2-LTCK im arteriellen glatten Muskel (aGM; kardiovaskuläre Nebenwirkungen) begrenzt. Im Jahr 2012 wurde die Entdeckung des ersten mutmaßlichen Cav1.3-selektiven Blockers Cp8 berichtet, der Cav1.2-vermittelte Nebenwirkungen umgehen würde. In meiner Arbeit habe ich Cp8-Effekte auf transient transfizierte Cav1.2- und Cav1.3-Konstrukte in tsA-201-Zellen unter Verwendung der whole-cell Patch-Clamp Methode charakterisiert. Überraschenderweise habe ich keine selektive oder starke LTCK-Hemmung, sondern eine nicht-selektive Aktivierung beider LTCK-Gehirn Isoformen gefunden. In Abwesenheit von selektiven Cav1.3-Blockern könnten verfügbare nicht-selektive LTCC-Inhibitoren für die Behandlung von Hirnstörungen genutzt werden. Bei Parkinson verursacht der Dopamin-(DA)-Schwund aufgrund des selektiven Verlustes von DA Substantia nigra (SN)-Neuronen die schweren Motorsymptome dieser Krankheit und es wird vermutet, dass LTCK eine Rolle bei der selektiven Anfälligkeit dieser Neuronen spielen. Das DHP-Isradipin (ISR) wird bereits in einer klinischen Phase-III-Studie für die Therapie von frühen Parkinson-Patienten getestet, obwohl die blockierende Wirksamkeit von ISR bei neuronalen Aktivitätsmustern unbekannt ist. Daher habe ich die ISR-vermittelte Modulation von Cav1.2 und kurzen und langen Cav1.3-Spleißvarianten, die stabil in HEK293-Zellen exprimiert wurden, während SN-DA-Neuron- und aGM-ähnlichen Befehlsspannungen untersucht. Meine Experimente legen nahe, dass bei SN-DA-ähnlicher Schrittmacher-Aktivität nur ein Fünftel aller LTCK aktiv ist und nur Cav1.3-Isoformen, das betrachtete Hauptziel für Neuroprotektion, Ca2+ auch zwischen Aktionspotentialen (AP) leiten. ISR blockierte Cav1.2 während einer aGM-ähnlichen Aktivität mit einem IC50 von 1.5 (95% CI: 1.2-1.7) nM, während Cav1.2 während der SN-DA-ähnlichen Aktivität 2-mal höhere Konzentrationen erforderte. Lange oder kurze Cav1.3-Spleißvarianten wurden durch 5- oder 11-mal höhere ISR-Konzentrationen im Vergleich zu aGM Cav1.2 inhibiert. Diese Daten zeigen, dass tolerierbare therapeutische Plasmakonzentrationen, die aGM Cav1.2-LTCK stark blockieren (Vasodilatation), höchstwahrscheinlich nicht effizient genug neuronale LTCK erreichen/inhibieren, insbesondere Cav1.3-Varianten (potentielle Neuroprotektion). Während meiner Dissertation habe ich auch mit Dr. Kai Schönig und Prof. Dusan Bartsch eine Kollaboration begonnen, um mit der neuen Genetic Engineering-Methode CRISPR/Cas9 transgene Mausmodelle zweier krankheitsrelevanter menschlicher CACNA1D (Cav1.3) Mutationen zu generieren. Die beiden de novo Punktmutationen wurden bei Patienten mit Autismus-Spektrum-Störung (A749G) oder einem komplexen Syndrom mit primärem Aldosteronismus, Krampfanfällen und neurologischen Anomalien (PASNA, I750M) identifiziert. Diese Mausmodelle würden es uns ermöglichen zu untersuchen, ob die Mutationen krankheitsverursachend sind und ob die betroffenen Individuen von der Behandlung mit LTCK-Blockern profitieren würden. Leider wurden in diesem Projekt keine überlebenden transgenen Nachkommen gewonnen, was in einer aktuellen Zusammenarbeit mit der Firma Taconic Biosciences zur Schaffung des A749G Autismus-assoziierten Mausmodells resultierte.Voltage-gated L-type Ca2+ channels (LTCCs) enable cellular Ca2+-influx in response to membrane depolarization, thereby regulating many body functions such as muscle contraction, endocrine secretion or Ca2+-dependent gene transcription and there is accumulating evidence for an involvement of LTCCs in brain disorders. In my thesis I investigated the pharmacological modulation of the two brain LTCC isoforms, Cav1.2 and Cav1.3, and their implication in Parkinsons disease (PD) and neuropsychiatric disorders. Ca2+ channel blockers (CCBs) such as antihypertensives of the dihydropyridine (DHP) family are available since decades, but their dosage is limited due to the preferred block of Cav1.2 LTCCs in the arterial smooth muscle (aSM; cardiovascular side effects). In 2012 the discovery of the first putative Cav1.3-selective blocker Cp8 was reported that would circumvent Cav1.2-mediated side effects. In my thesis I characterized Cp8 effects on transiently transfected Cav1.2 and Cav1.3 constructs in tsA-201 cells using whole-cell patch-clamp recordings. Unexpectedly, I did not observe selective or potent LTCC inhibition, but a non-selective activation of both LTCC brain isoforms. In the absence of selective Cav1.3-blocking agents, available non-selective LTCC inhibitors could be repurposed for the treatment of brain disorders. In PD, dopamine (DA) depletion due to the selective loss of DA Substantia nigra (SN) neurons cause the severe motor symptoms of this disease and it is hypothesized that LTCCs play a role in the selective vulnerability of these neurons. The DHP isradipine (ISR) already entered a phase-III clinical trial for the therapy of early PD patients, although the blocking efficacy of ISR during neuronal activity patterns is unknown. Therefore I investigated the ISR-mediated modulation of Cav1.2 and short and long Cav1.3 splice variants stably expressed in HEK293 cells during SN DA neuron- and aSM-like command voltages. My experiments suggest that during regular SN DA-like pacemaking only one fifth of all LTCCs are active and only Cav1.3 isoforms, the considered main target for neuroprotection, conduct Ca2+ also in between action potentials (APs). ISR blocked Cav1.2 during aSM-like activity with an IC50 of 1.5 (95 % CI: 1.2-1.7) nM, while Cav1.2 during SN DA-like activity required 2-times higher concentrations. Long or short Cav1.3 splice variants were inhibited by 5- or 11-times higher ISR concentrations compared to aSM Cav1.2, respectively. These data indicate that tolerable therapeutic plasma concentrations that potently block aSM Cav1.2 LTCCs (vasodilation) will most likely not efficiently engage neuronal LTCCs, especially Cav1.3 variants (potential neuroprotection). During my thesis I also started a collaboration with Dr. Kai Schönig and Prof. Dusan Bartsch in order to generate transgenic mouse models of two disease-relevant human CACNA1D (Cav1.3) mutations using the new genome editing approach CRISPR/Cas9. The two de novo point mutations were identified in patients suffering from ASD (A749G) or a complex syndrome characterized by primary aldosteronism, seizures and neurological abnormalities (PASNA; I750M). These mouse models would enable us to investigate if the mutations are disease-causing and if affected individuals may benefit from the treatment with LTCC blockers. Unfortunately no surviving transgenic offspring was obtained in this project, resulting in a current collaboration with the company Taconic Biosciences to create the A749G ASD-associated mouse model.Mag. rer. nat. Nadine Jasmin OrtnerIm Titel ist 2+ jeweils hochgestellt.Universität Innsbruck, Dissertation, 2016OeBB(VLID)152162

beta 2-subunit alternative splicing stabilizes Cav2.3 Ca2+ channel activity during continuous midbrain dopamine neuron-like activity

In dopaminergic (DA) Substantia nigra (SN) neurons Cav2.3 R-type Ca2+-currents contribute to somatodendritic Ca2+-oscillations. This activity may contribute to the selective degeneration of these neurons in Parkinson's disease (PD) since Cav2.3-knockout is neuroprotective in a PD mouse model. Here, we show that in tsA-201-cells the membrane-anchored beta 2-splice variants beta 2a and beta 2e are required to stabilize Cav2.3 gating properties allowing sustained Cav2.3 availability during simulated pacemaking and enhanced Ca2+-currents during bursts. We confirmed the expression of beta 2a- and beta 2e-subunit transcripts in the mouse SN and in identified SN DA neurons. Patch-clamp recordings of mouse DA midbrain neurons in culture and SN DA neurons in brain slices revealed SNX-482-sensitive R-type Ca2+-currents with voltage-dependent gating properties that suggest modulation by beta 2a- and/or beta 2e-subunits. Thus, beta-subunit alternative splicing may prevent a fraction of Cav2.3 channels from inactivation in continuously active, highly vulnerable SN DA neurons, thereby also supporting Ca2+ signals contributing to the (patho)physiological role of Cav2.3 channels in PD