Diagnosis of rabies and eastern and western equine viral encephalitides in equids by multiplex Hemi-Nested RT-PCR technique

Financial support: CNPq and Pasteur Institute of São PauloTrabalho apresentado à 23ª Reunião Internacional da Raiva nas Américas, 2012, São Paulo

Inhibition of replication of rabies virus in vivo and in vitro using RNA interference

A raiva é uma zoonose que afeta todos os mamíferos e causa cerca de 55.000 mortes humanas por ano, causada pelo vírus da raiva. O vírus da raiva pertence à Ordem Mononegavirales, Família Rhabdoviridae e o Gênero Lissavirus. Atualmente, o tratamento humano se baseia no uso do Protocolo de Milwaukee composto de indução do paciente ao coma e uso de massiva terapia antiviral. O protocolo, apesar de ter sido utilizado duas vezes com sucesso, inclusive em um caso brasileiro, ainda requer aprimoramentos. Neste sentido, a interferência por RNA (RNAi) é uma nova abordagem para terapia de doenças virais. O objetivo deste trabalho foi avaliar a inibição da replicação do vírus da raiva in vitro e in vivo utilizando RNAi. Para tanto, foram utilizados três siRNAs (siRNA 124, siRNA 750, siRNA B) com a fita antisenso complementar ao mRNA da nucleoproteína (N) do vírus da raiva. Para o ensaio in vitro foram utilizadas a cepa PV do vírus da raiva e as células de BHK-21 (Baby hamster kidney). As monocamadas celulares foram infectadas com a cepa PV e depois de 2 horas de incubação transfectadas com cada um dos siRNAs em combinação com Lipofectamine 2000®. Depois de 22 horas as placas teste e controle foram submetidas à imunofluorescência direta (IFD) com conjugado globulina de coelho anti-nucleocapsídeo do vírus da raiva/isotiocianato de fluoresceína (BIO-RADTM). Os resultados revelaram títulos de 5,71logTCID50/ml, 5,56logTCID50/ml e 5,65logTCID50/ml para os siRNAs 124, B e 750, respectivamente, enquanto que, para a placa controle, o título foi 6,43logTCID50/ml. Para o ensaio in vivo, foram usados camundongos albino suíços de 21 dias com peso entre 11 e 14g, infectados com a cepa PV via intracerebral. Duas horas depois da infecção foi inoculada por via intracerebral uma solução do \"pool\" dos três siRNAs com Lipofectamine 2000® . Os animais com paralisia foram sacrificados e aqueles sobreviventes foram observados até completar 30 dias de observação quando foram, então, sacrificados. O sistema nervoso central de todos os animas foi recolhido e submetido a IFD. O título viral do grupo teste foi 7.03logLD50%/ml e do grupo controle 7.13logLD50%/ml. O resultado do ensaio in vitro demonstra que os siRNAs utilizados são efetivos em inibir a replicação do vírus da raiva, com eficiências equivalentes. A utilização do \"pool\" dos três siRNA em camundongos resultou em 30% de animais sobreviventes frente a 100 DL50% do vírus PV, enquanto que a mesma dose levou a 100% de mortalidade nos animais não tratados. Pode-se atribuir a menor eficiência em inibir a replicação do vírus da raiva in vivo quando se compara com os resultados in vitro possivelmente às elevadas doses virais utilizadas. Estes resultados, ainda que indiquem a necessidade de mais estudos, permitem concluir que a RNAi é uma tecnologia promissora como antiviral contra a raiva.Rabies is a zoonotic disease that affects all mammals and causes more than 55.000 human deaths every year, caused by rabies virus (RABV) a virus of the Mononegavirales order, Family Rhabdoviridae and the Lissavirus genus. After the onset of the symptoms, the illness has a fast progression and the patients feel intense physical suffering. Currently, human rabies treatment has been based on the Milwaukee Protocol which consists on the induction of coma and massive antiviral therapy. Despite this protocol has been successful in two cases, including a Brazilian case (Recife State), more studies on antiviral for human rabies treatment are required. RNA interference is a new antiviral approach, which gives hope to the possibility of rabies antiviral treatment. The aim of this study was to assess the decrease in the titer of rabies virus in vitro and in vivo using short-interfering RNAs. For this purpose, three siRNAs (siRNA 124, siRNA B, siRNA 750) were used with antisense strands complementary to rabies virus nucleoprotein (N) mRNA. Pasteur virus strain (PV) of rabies virus and BHK-21 cells were used, and the monolayers were transfected with each of tree RNAs with Lipofectamine-2000. After 22 hours, the siRNA-treated and the control plates were tested by direct fluorescent antibody test (DFAT) with anti-rabies virus nucleocapsid antibody conjugate with fluorescein isothiocianate. Virus titers were calculated by the Spearman-Karber method. The results revealed that all three siRNAs reduced the titer of PV strain and a more intense effect was obtained with siRNA B. The titer of the PV strain in the control plate was 6.43lg TCID50%/ml and 5.56lg TCID50%/ml in the plate treated with siRNA B, respectively. The similar result was obtained in plates treated with siRNAs 124 and 750. The title of PV strain of these plates was 5.71lg TCID50%/ml of siRNA 124 and 5.65lg TCID50%/ml of siRNA750, respectively. No cytopathic or cytotoxic effect was observed in the monolayers treated with Lipofectamine-2000®. Swiss albino mice with 21 days weighing between 11 and 14g infected with strain PV by the intracerebral route used in this in vivo essay. After two hours of infection, a pool solution of 3 siRNAs with lipofectamine was also inoculated by the intracerebral route. The animals with paralysis were euthanized and those which survived were observed until the 30th day when they were also euthanized. The central nervous system of all animals were collected and induced to IFD. The title viral test group was 7.03logLD50%/ml and the control group was 7.13logLD50%/ml. The in vitro test results indicate that siRNAS are effective in inhibiting the replication of rabies virus with similar efficiencies. The use of the pool of three siRNA in mice resulted in 30% of survivors for 100 LD50% of PV virus, while the same dose led to 100% mortality in untreated animals. A lower efficiency in inhibiting the replication of rabies virus in vivo when compared with results in vitro could be possibly due to the high viral doses used. These results, although indicative of the need for further studies, show that RNAi is a promising technology as antiviral against rabies

Inhibition of replication of rabies virus in vivo and in vitro using RNA interference

A raiva é uma zoonose que afeta todos os mamíferos e causa cerca de 55.000 mortes humanas por ano, causada pelo vírus da raiva. O vírus da raiva pertence à Ordem Mononegavirales, Família Rhabdoviridae e o Gênero Lissavirus. Atualmente, o tratamento humano se baseia no uso do Protocolo de Milwaukee composto de indução do paciente ao coma e uso de massiva terapia antiviral. O protocolo, apesar de ter sido utilizado duas vezes com sucesso, inclusive em um caso brasileiro, ainda requer aprimoramentos. Neste sentido, a interferência por RNA (RNAi) é uma nova abordagem para terapia de doenças virais. O objetivo deste trabalho foi avaliar a inibição da replicação do vírus da raiva in vitro e in vivo utilizando RNAi. Para tanto, foram utilizados três siRNAs (siRNA 124, siRNA 750, siRNA B) com a fita antisenso complementar ao mRNA da nucleoproteína (N) do vírus da raiva. Para o ensaio in vitro foram utilizadas a cepa PV do vírus da raiva e as células de BHK-21 (Baby hamster kidney). As monocamadas celulares foram infectadas com a cepa PV e depois de 2 horas de incubação transfectadas com cada um dos siRNAs em combinação com Lipofectamine 2000®. Depois de 22 horas as placas teste e controle foram submetidas à imunofluorescência direta (IFD) com conjugado globulina de coelho anti-nucleocapsídeo do vírus da raiva/isotiocianato de fluoresceína (BIO-RADTM). Os resultados revelaram títulos de 5,71logTCID50/ml, 5,56logTCID50/ml e 5,65logTCID50/ml para os siRNAs 124, B e 750, respectivamente, enquanto que, para a placa controle, o título foi 6,43logTCID50/ml. Para o ensaio in vivo, foram usados camundongos albino suíços de 21 dias com peso entre 11 e 14g, infectados com a cepa PV via intracerebral. Duas horas depois da infecção foi inoculada por via intracerebral uma solução do \"pool\" dos três siRNAs com Lipofectamine 2000® . Os animais com paralisia foram sacrificados e aqueles sobreviventes foram observados até completar 30 dias de observação quando foram, então, sacrificados. O sistema nervoso central de todos os animas foi recolhido e submetido a IFD. O título viral do grupo teste foi 7.03logLD50%/ml e do grupo controle 7.13logLD50%/ml. O resultado do ensaio in vitro demonstra que os siRNAs utilizados são efetivos em inibir a replicação do vírus da raiva, com eficiências equivalentes. A utilização do \"pool\" dos três siRNA em camundongos resultou em 30% de animais sobreviventes frente a 100 DL50% do vírus PV, enquanto que a mesma dose levou a 100% de mortalidade nos animais não tratados. Pode-se atribuir a menor eficiência em inibir a replicação do vírus da raiva in vivo quando se compara com os resultados in vitro possivelmente às elevadas doses virais utilizadas. Estes resultados, ainda que indiquem a necessidade de mais estudos, permitem concluir que a RNAi é uma tecnologia promissora como antiviral contra a raiva.Rabies is a zoonotic disease that affects all mammals and causes more than 55.000 human deaths every year, caused by rabies virus (RABV) a virus of the Mononegavirales order, Family Rhabdoviridae and the Lissavirus genus. After the onset of the symptoms, the illness has a fast progression and the patients feel intense physical suffering. Currently, human rabies treatment has been based on the Milwaukee Protocol which consists on the induction of coma and massive antiviral therapy. Despite this protocol has been successful in two cases, including a Brazilian case (Recife State), more studies on antiviral for human rabies treatment are required. RNA interference is a new antiviral approach, which gives hope to the possibility of rabies antiviral treatment. The aim of this study was to assess the decrease in the titer of rabies virus in vitro and in vivo using short-interfering RNAs. For this purpose, three siRNAs (siRNA 124, siRNA B, siRNA 750) were used with antisense strands complementary to rabies virus nucleoprotein (N) mRNA. Pasteur virus strain (PV) of rabies virus and BHK-21 cells were used, and the monolayers were transfected with each of tree RNAs with Lipofectamine-2000. After 22 hours, the siRNA-treated and the control plates were tested by direct fluorescent antibody test (DFAT) with anti-rabies virus nucleocapsid antibody conjugate with fluorescein isothiocianate. Virus titers were calculated by the Spearman-Karber method. The results revealed that all three siRNAs reduced the titer of PV strain and a more intense effect was obtained with siRNA B. The titer of the PV strain in the control plate was 6.43lg TCID50%/ml and 5.56lg TCID50%/ml in the plate treated with siRNA B, respectively. The similar result was obtained in plates treated with siRNAs 124 and 750. The title of PV strain of these plates was 5.71lg TCID50%/ml of siRNA 124 and 5.65lg TCID50%/ml of siRNA750, respectively. No cytopathic or cytotoxic effect was observed in the monolayers treated with Lipofectamine-2000®. Swiss albino mice with 21 days weighing between 11 and 14g infected with strain PV by the intracerebral route used in this in vivo essay. After two hours of infection, a pool solution of 3 siRNAs with lipofectamine was also inoculated by the intracerebral route. The animals with paralysis were euthanized and those which survived were observed until the 30th day when they were also euthanized. The central nervous system of all animals were collected and induced to IFD. The title viral test group was 7.03logLD50%/ml and the control group was 7.13logLD50%/ml. The in vitro test results indicate that siRNAS are effective in inhibiting the replication of rabies virus with similar efficiencies. The use of the pool of three siRNA in mice resulted in 30% of survivors for 100 LD50% of PV virus, while the same dose led to 100% mortality in untreated animals. A lower efficiency in inhibiting the replication of rabies virus in vivo when compared with results in vitro could be possibly due to the high viral doses used. These results, although indicative of the need for further studies, show that RNAi is a promising technology as antiviral against rabies

Post-transcriptional gene silencing by RNA interference (RNAi) as antiviral therapy for rabies

A raiva é uma zoonose que afeta todos os mamíferos e causa cerca de 55.000 mortes humanas por ano, causada pelo vírus da raiva. O vírus da raiva pertence à Ordem Mononegavirales, Família Rhabdoviridae e o Gênero Lyssavirus. Ultimamente, o Protocolo de Milwaukee é a base do tratamento humano, com indução do paciente ao coma e uso de massiva terapia antiviral. O protocolo, embora tenha sido utilizado duas vezes com sucesso, inclusive em um caso brasileiro, ainda requer aperfeiçoamentos. Neste sentido, a interferência por RNA (RNAi) é uma nova abordagem para terapia de doenças virais. O objetivo deste trabalho foi avaliar a inibição da replicação do vírus da raiva in vitro e in vivo utilizando RNAi. Para este fim, foram utilizados três siRNAs (siRNA 360, siRNA 652, siRNA 649) com a fita antisenso complementar ao mRNA da fosfoproteína (P) e três siRNAs (Le 1, Le 2, Le 3) contra o RNA líder do vírus da raiva. Para o ensaio in vitro foram utilizadas as amostras PV e 4005 (AgV3) do vírus da raiva e as células de BHK-21 (Baby hamster kidney). As monocamadas celulares foram infectadas com as amostras PV ou 4005 e depois de 2 horas de incubação transfectadas com cada um dos siRNAs em combinação com Lipofectamine 2000TM. Depois de 24 e 48 horas as placas teste e controle foram submetidas à imunofluorescência direta (IFD) com conjugado globulina de coelho anti-ribonucleocapsídeo do vírus da raiva/isotiocianato de fluoresceína (Instituto Pasteur de São Paulo). Os resultados revelaram que os siRNAs contra o RNA líder do vírus não foram capazes de inibir a replicação do vírus. A utilização dos siRNAs contra mRNA P resultaram em títulos de 3,625logTCID50/ml, 3,875logTCID50/ml e 4,125logTCID50/ml para os siRNAs 360, 649 e 652, respectivamente, enquanto que, para a placa controle, o título foi 4,0logTCID50/ml nas placas infectadas com PV e período de incubação de 24h. Nas placas infectadas com a amostra 4005 e tratadas com siRNAs, a maior queda de título viral foi na placa tratada com siRNA 360, de 1,0 log, comparando-se com a placa controle de incubação de 24 para a amostra 4005. Nas placas tratadas com siRNA 649 e siRNA 652, também houve a diminuição de título viral, mas em uma escala menor (0,25log e 0,125log, respectivamente) comparando-se com o controle. Nas placas infectadas com PV e incubadas durante 48h, os títulos apresentados foram de 5,625logTCID50/ml, 4,625logTCID50/ml e 4,75logTCID50%/ml para os siRNAs 360, 649 e 652, respectivamente, enquanto que na placa controle o título foi 6,0logTCID50C%/ml. A placa com período de incubação de 48h com a amostra 4005 e tratada com siRNA 360 apresentou a maior queda de título viral entre os três siRNAs, o que resultou em 1,125log de diferença. Nas monocamadas onde foram administrados siRNA 649 e siRNA 652, observou-se também uma pequena queda de título viral igual a 0,875log e 0,295log, respectivamente, comparando-se com a placa não tratada. Para o ensaio in vivo, foram usados camundongos albino suíços de 21 dias com peso entre 11 e 14g, infectados com a cepa PV e AgV3 em 10DL50% via intracerebral. Duas horas depois da infecção, foi inoculada por via intracerebral uma solução do siRNA 360 com Lipofectamine 2000TM. Os animais com paralisia foram eutanasiados e aqueles sobreviventes foram observados até completar 30 dias de observação quando foram, então, eutanasiados. O sistema nervoso central de todos os animas foi recolhido e submetido a IFD. A utilização do siRNA 360 em camundongos resultou em 30% de animais sobreviventes frente amostra 4005, enquanto que a mortalidade nos animais não tratados foi de 90%. Nos animais inoculados com a amostra PV e tratados com este siRNA, a sobrevivência foi de 40%, enquanto que no grupo controle a mortalidade foi de 100%. O resultado do ensaio in vitro demonstra que os siRNAs utilizados são capazes de inibir a replicação do vírus da raiva, com eficiência mais pronunciada para o siRNA 360. In vivo, este siRNA foi capaz de induzir a proteção parcial dos animais inoculados com as duas variantes virais. Estes resultados, ainda que indiquem a necessidade de mais estudos, permitem concluir que a RNAi é uma tecnologia promissora como antiviral contra a raivaRabies is a zoonotic disease that affects all mammals and causes more than 55.000 human deaths every year, caused by rabies virus (RABV) a virus of the Mononegavirales order, Family Rhabdoviridae and the Lyssavirus genus. After the onset of the symptoms, the illness has a fast progression and the patients feel intense physical suffering. Currently, human rabies treatment has been based on the Milwaukee Protocol which consists on the induction of coma and massive antiviral therapy. Despite this protocol has been successful in two cases, including a Brazilian one, more studies on antivirals for human rabies treatment are required. RNA interference is a new antiviral approach, which gives hope to the possibility of rabies antiviral treatment. The aim of this study was to assess the decrease in titres of rabies virus in vitro and in vivo using short-interfering RNAs. To this end, three siRNAs (siRNA 360, siRNA 652, and siRNA 649) were used with antisense strands complementary to rabies virus phosphoprotein (P) mRNA and three other (Le 1, Le 2, Le 3) to the leader RNA. Pasteur virus strain (PV) and strain 4005 (AgV3) of rabies virus and BHK-21 cells were used, and the monolayers were transfected with each of the RNAs with Lipofectamine-2000 TM. After 22 hours, the siRNA-treated and the control plates were tested by direct fluorescent antibody test (DFAT) with anti-rabies virus nucleocapsid antibody conjugate with fluorescein isothiocianate (Pasteur Insitutte, Brazil). The plates transfected with siRNA against phosphoprotein mRNA were also incubated for 48 hours and subjected to IFD assay. Virus titres were calculated by the Spearman-Karber method. The results showed that siRNAs against virus leader RNA were not able to inhibit the replication of the virus. The use of siRNAs against P mRNA resulting titres of 3.625logTCID50/ml 3.875logTCID50/ml and 4.125logTCID50/ml for siRNAs 360, 649 and 652, respectively, while, for the control plate, the titre was 4.0logTCID50/ml in plates with PV and 24h incubation period. In plates with strain 4005 and treated with siRNAs, the highest viral titre decrease was obtained with siRNA 360, with a 1.0 log difference compared to the control plate of strain 4005 incubated for 24h. The plates treated with siRNA 649 and siRNA 652 have was also shown a decrease in viral titres, but on a smaller scale (0.25log and 0.125log, respectively) compared to the control. The plates infected with PV and incubated for 48 hours showed titre of 5.625logTCID50/ml, 4.625logTCID50/ml and 4.75logTCID50%/ml for siRNAs 360, 649 and 652, respectively, while for the control plate the titre was 6.0logTCID50C%/ml. The plate with strain 4005 and then treated with siRNA360 and incubated for a total of 48h had the highest viral titre decrease among the three siRNAs, which resulted in a 1.125log difference compared to the control plate. In monolayers treated with siRNA649 and siRNA652 there was also a discrete drop in viral titres (0.875log and 0.295log, respectively) compared to the control plate. For the in vivo assay, 21-day old Swiss albino mice weighing between 11 and 14g were intracerebrally inoculated with PV or 4005 strains (10DL50%). Two hours after inoculation, a solution of siRNA360 with Lipofectamine 2000 TM was also intracerebrally injected. Mice presenting paralysis and those that survived the 30 days of observation were euthanized. The central nervous system of all animals was collected and submitted to IFD. The use of siRNA360 in mice resulted in survival of 30% of animals in the group inoculated with strain 4005, whereas 90% mortality was observed in the control group. In animals inoculated with the PV strain, and treated with siRNA360, the survival rate was 40% and in the control group the mortality was 100%. The results of the in vitro assay demonstrate that the siRNAs used are effective in inhibiting the replication of rabies virus with a more intense inhibition regarding siRNA 360. In vivo, this siRNA was able to induce partial protection of animals infected with both viral variants. These results also indicate that, despite the need for further studies, RNAi is a promising technology as antiviral against rabie