Fast Two-Photon Excited Fluorescence Imaging for the Human Retina

In der vorliegenden Doktorarbeit wird ein neuartiges Zwei-Photonen-Mikrosokop, basierend auf einem schnellen ophthalmoskopischen Scanner, zur hochauflösenden strukturellen und funktionellen Abbildung der menschlichen Netzhaut entwickelt und aufgebaut. An menschlichen Spenderaugen werden die Autofluoreszenzeigenschaften der Netzhaut erprobt und auf ihren diagnostischen Wert hin analysiert. Die sich auf dem retinalen Pigmentepithel (RPE) mit Alter und Krankheit ansammelnde Lipofuszingranula können dabei hochauflösend mit Hilfe der Zwei-Photonen-Anregung abgebildet werden. Exzessive Lipofuszinmengen im RPE werden in der Ophthalmologie als mögliche Ursache für die Pathogenese u.a. der altersabhängigen Makulardegeneration (AMD) vermutet und dessen hochauflösende, selektive Anregung mittels Zwei-Photonen-Absorption erscheint besonders interessant. Zudem ist es erstmals möglich, die feinen Photorezeptor Zapfen und Stäbchen sowie die darüberliegenden Ganglionzellen und Nervenfaserschicht der neurosensorischen Netzhaut mittels Zwei-Photonen Autofluoreszenz darzustellen, allerdings sind dazu höhere Anregungsenergien nötig. Desweiteren wird die Abhängigkeit von kurzen Pixelverweilzeiten auf die Fluoreszenzausbeute untersucht. Am RPE Lipofuszin wird experimentell nachgewiesen, dass vermutlich aufgrund von unterdrückter Tripletzustand Ansammlung, durch schnelles Scannen eine Fluoreszenzsignalzunahme erzielt werden kann. Zuletzt wird die potenzielle Anwendung am lebenden menschlichen Auge zur diagnostischen Abbildung der RPE Zellschicht simuliert und diskutiert. Die Anwendung der Zwei-Photonen Scanning-Laser-Ophthalmoskopie erscheint unseren Berechnungen, nach neuesten Lasersicherheitsbestimmungen, zufolge als nichtinvasiv

Quantitative analysis of fluorescence lifetime measurements of the macula using the fluorescence lifetime imaging ophthalmoscope in healthy subjects.

PURPOSE Fundus autofluorescence (FAF) cannot only be characterized by the intensity or the emission spectrum, but also by its lifetime. As the lifetime of a fluorescent molecule is sensitive to its local microenvironment, this technique may provide more information than fundus autofluorescence imaging. We report here the characteristics and repeatability of FAF lifetime measurements of the human macula using a new fluorescence lifetime imaging ophthalmoscope (FLIO). METHODS A total of 31 healthy phakic subjects were included in this study with an age range from 22 to 61 years. For image acquisition, a fluorescence lifetime ophthalmoscope based on a Heidelberg Engineering Spectralis system was used. Fluorescence lifetime maps of the retina were recorded in a short- (498-560 nm) and a long- (560-720 nm) spectral channel. For quantification of fluorescence lifetimes a standard ETDRS grid was used. RESULTS Mean fluorescence lifetimes were shortest in the fovea, with 208 picoseconds for the short-spectral channel and 239 picoseconds for the long-spectral channel, respectively. Fluorescence lifetimes increased from the central area to the outer ring of the ETDRS grid. The test-retest reliability of FLIO was very high for all ETDRS areas (Spearman's ρ = 0.80 for the short- and 0.97 for the long-spectral channel, P < 0.0001). Fluorescence lifetimes increased with age. CONCLUSIONS The FLIO allows reproducible measurements of fluorescence lifetimes of the macula in healthy subjects. By using a custom-built software, we were able to quantify fluorescence lifetimes within the ETDRS grid. Establishing a clinically accessible standard against which to measure FAF lifetimes within the retina is a prerequisite for future studies in retinal disease