Modulation of B-cell endoplasmic reticulum calcium homeostasis by Epstein-Barr virus Latent Membrane Protein-1

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The boron-oxygen core of borinate esters is responsible for the store-operated calcium entry potentiation ability

International audienceBACKGROUND: Store-Operated Calcium Entry (SOCE) is the major Ca2+ ion entry pathway in lymphocytes and is responsible of a severe combined immunodeficiency (SCID) when deficient. It has recently been observed or highlighted in other cell types such as myoblasts and neurons, suggesting a wider physiological role of this pathway. Whereas Orai1 protein is considered to be the channel allowing the SOCE in T cells, it is hypothesized that other proteins like TRPC could associate with Orai1 to form SOCE with different pharmacology and kinetics in other cell types. Unraveling SOCE cell functions requires specific effectors to be identified, just as dihydropyridines were crucial for the study of Ca2+ voltage-gated channels, or spider/snake toxins for other ion channel classes. To identify novel SOCE effectors, we analyzed the effects of 2-aminoethyl diphenylborinate (2-APB) and its analogues. 2-APB is a molecule known to both potentiate and inhibit T cell SOCE, but it is also an effector of TRP channels and endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase. RESULTS: A structure-function analysis allowed to discover that the boron-oxygen core present in 2-APB and in the borinate ester analogues is absolutely required for the dual effects on SOCE. Indeed, a 2-APB analogue where the boron-oxygen core is replaced by a carbon-phosphorus core is devoid of potentiating capacity (while retaining inhibition capacity), highlighting the key role of the boron-oxygen core present in borinate esters for the potentiation function. However, dimesityl borinate ester, a 2-APB analogue with a terminal B-OH group showed an efficient inhibitory ability, without any potentiating capacity. The removal or addition of phenyl groups respectively decrease or increase the efficiency of the borinate esters to potentiate and inhibit the SOCE. mRNA expression revealed that Jurkat T cells mainly expressed Orai1, and were the more sensitive to 2-APB modulation of SOCE. CONCLUSIONS: This study allows the discovery of new boron-oxygen core containing compounds with the same ability as 2-APB to both potentiate and inhibit the SOCE of different leukocyte cell lines. These compounds could represent new tools to characterize the different types of SOCE and the first step in the development of new immunomodulators

Modulation des courants K+ et Ca2+ des cellules T Jurkat par la glycoprotéine gp160 du virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1)

During HIV infection, there is a hyperactivation of the immun system, with immun cell dysfunctionning. CD4+ T cells are the major target cells of HIV. Cell infection by HIV is consecutive of the viral envelope glycoprotein gp120 interaction with the receptor CD4. After this contact, CD4+ cellsdisappear from the blood and/or have functionnal disruption. During this work, we show that Jurkat E6.1 and JCaM1.6 cells possess two K+ voltage-gated current: Kv1.3, which is inhibited by charybdotoxin, and K(V) CTX-I, which is not. Gp160, the gp120 precusor protein can disturb the K+ and Ca2+ currents. Gp160 decreases rapidly the intensity of the two K+ voltage-gated currents, by a p56lck process. In contrast, with longer times, gp160 only reduces the Kv1.3 current by a PKC-dependent process. K(V) current regulates the membrane potential. Thus, the K+ current disruption could explain the CD4 T cell membrane depolarization. Gp160 decreases the Ca2+ influx. This decrease could be due to a decrease of the CRAC channel number and/or an increase of CRAC channel affinity for Ca2+ ions, whch speeds the channel inactivation. This Ca2+ influx decrease can be linked to the transitory hyperpolarization obtained after cell activation by PHA. These ionic current modifications could explain the CD4+ T cells function disruption of infected patients.Lors de l'infection par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH), il y a une hyperactivation chronique du système immunitaire contrastant avec une dérégulation des fonctions des cellules immunitaires. L'infection des cellules T CD4+ par le VIH est consécutive de l'interaction entre la glycoprotéine d'enveloppe du virus, la gp120 et le récepteur CD4. Suite à ce contact, les cellules T CD4+ disparaissent de la circulation sanguine et/ou connaissent des anomalies fonctionnelles. Dans ce travail, nous avons montré que les cellules Jurkat E6.1 et JCaM1.6 possèdent deux types de courant K(V): Kv1.3, inhibé par la charybdotoxine, et K(V) CTX-I, résistant à cette inhibition. La gp160, la protéine précurseur de la gp120, est capable de modifier les courants K+ et Ca2+. Ainsi, instantanément, la gp160 induit la diminution de l'intensité des deux courants K(V) par un processus dépendant de la protéine tyrosine kinase p56lck. A des temps retardés, la gp160 réduit l'intensité du courant Kv1.3 par un processus dépendant de la PKC. Le courant K(V) régule le potentiel de membrane des cellules T. Ainsi, la modification de l'intensité des courants K(V) pourraient expliquer la dépolarisation membranaires des cellules. La gp160 réduit l'influx Ca2+ à travers les canaux CRAC. Cette diminution pourrait être due à une baisse du nombre de canaux CRAC et/ou une augmentation de l'affinité des canaux CRAC pour les ions Ca2+, ce qui accélère leur inactivation. Cette diminution de l'influx Ca2+ pourrait être lié à l'hyperpolarisation transitoire obtenue après activation des cellules avec la phytohémagglutinine. L'ensemble des modifications des courants ioniques pourraient être à l'origine de la perturbation fonctionnelle des lymphocytes T CD4+ des sujets infectés

Caractérisation des canaux calciques dans les polynucléaires neutrophiles (rôle dans la phagocytose et la production des radicaux libres oxygénés)

Les polynucléaires neutrophiles représentent 50-70% des leucocytes sanguins et possèdent un rôle majeur dans la défense de l organisme contre les pathogènes. Le Ca2+ est un second messager qui joue un rôle primordial dans le chimiotactisme, la phagocytose, la dégranulation et la production de formes réactives de l oxygène (FRO) afin de neutraliser l agent pathogène. Dans ces cellules, l influx calcique de type SOCE est essentiel pour l'homéostasie calcique. Il est peu étudié en raison du manque d outils pharmacologiques spécifiques d où l importance dans un premier temps de chercher de nouvelles molécules. Les cellules T Jurkat dont le SOCE est largement caractérisé servent de modèle pour la caractérisation initiale de ces molécules. Le 2-APB est parmi les molécules les plus largement utilisées dans la caractérisation du SOCE en raison de sa double activité sur le SOCE avec une potentialisation à [1-10 M] et une inhibition à [> 20 M]. En revanche, ce produit manque de spécificité et agit sur d autres cibles cellulaires comme les récepteurs à l inositol (1,4,5)-trisphosphate (InsP3Rs). La 1ère étape est de sélectionner à partir d analogues commerciaux du 2-APB (Methoxy-APB, Dimethoxy-APB, Cyclic-APB, Benzothienyl-APB, Thienyl-APB et MDEB), des composés plus spécifiques et également plus efficaces que la molécule mère. Deux molécules se sont distinguées : le MDEB comme uniquement potentialisant du SOCE et le Benzothienyl-APB comme un puissant inhibiteur. En revanche, tous les analogues du 2-APB inhibent les InsP3Rs à l exception du MDEB qui semble plus spécifique du SOCE. L effet du MDEB sur le courant calcique, ICRAC, a été étudié grâce à la technique du patch-clamp. Il augmente d environ 4 fois l amplitude de ICRAC par rapport à celle enregistrée dans les cellules contrôle. Par ailleurs, le MDEB ralentie l inactivation rapide de ICRAC due au Ca2+. Sur le plan physiologique, le MDEB à des concentrations croissantes inhibe la synthèse de l IL-2 dans les cellules Jurkat stimulées et ceci malgré son effet potentialisant du SOCE. Cette activité est liée à son effet pro-apoptotique dans les cellules Jurkat stimulées. Le MDEB et le Benzothienyl-APB caractérisés dans la 1ère partie nous ont servi d outils potentiels afin d étudier le SOCE des cellules PLB-985 différenciées en cellules proches de neutrophiles. Le SOCE a été induit soit par un traitement des cellules avec la thapsigargine (Tg) soit de manière physiologique avec les peptides fMLF et le WKYMVm deux chimioattractants, ligands des récepteurs aux peptides formylés FPR et FPRL1 respectivement. En plus, le SOCE induit par la Tg est modulable par le 2-APB, potentialisé par le MDEB et inhibé par le Benzothienyl-APB. La phagocytose des levures par les cellules PLB-985 différenciées ainsi que la production de FRO intraphagosomales ont été inhibées par le MDEB et le Benzothienyl-APB. Les FRO extracellulaires ont été également inhibées par Benzothienyl-APB en revanche à cause de la forte interférence du MDEB avec la technique de mesure nous n avons pas pu étudier ses activités. En conclusion, le MDEB et le Benzothienyl-APB sont de nouveaux outils pharmacologiques potentialisant ou inhibant le SOCE des leucocytes, qui nous permettront dans l avenir une meilleure compréhension de l'entrée calcique et ses rôles dans ces cellules.Neutrophils represent 50-70% of human blood leukocytes; their role is to protect the body against pathogens. Calcium is a second messenger which plays an important role in chemotaxis, phagocytosis, degranulation and the production of reactive oxygen species (ROS) in order to eliminate microbes. In neutrophils, the mechanism of store-operated calcium entry (SOCE) is essential for calcium homeostasis. However, neutrophil SOCE is not well understood because of the lack of specific pharmacological tools. It is necessary to first identify and characterize new molecules using a model of Jurkat T cells in which SOCE was the best characterized. 2-APB is the most widely used molecule in SOCE characterization due to its dual activity with a potentiation at lower concentrations [1-10 M] and an inhibition at higher concentrations [> 20 M]. However, this molecule lacks specificity because it acts on other cellular targets such as inositol (1,4,5)-trisphosphate receptors (InsP3Rs). The first step is to select from a library of 8 commercial 2-APB analogues (Methoxy-APB, Dimethoxy-APB, Cyclic-APB, Benzothienyl-APB, Thienyl-APB and MDEB) those that are more specific and also more efficient molecules than 2-APB. Two interesting molecules were identified, MDEB as the only SOCE potentiating product currently known and the Benzothienyl-APB, which is a strong inhibitor. Like 2-APB, all these analogues inhibit InsP3Rs except MDEB, which seems to be more specific. The effect of MDEB on the calcium current, ICRAC, was also studied using the patch-clamp technique. MDEB increases ~4 times the ICRAC amplitude in comparison with control. Otherwise, MDEB slows down the fast Ca2 +-dependent inactivation of ICRAC. Functionally, MDEB at increasing concentrations inhibits IL-2 synthesis in stimulated Jurkat T cells despite its potentiating activity on SOCE. The inhibition is due to MDEB induced apoptosis in stimulated Jurkat T cells. MDEB and Benzothienyl-APB were then used as tools to study SOCE in a neutrophil-like cell model, the differentiated PLB-985 cells. SOCE was induced either by treatment of cells with thapsigargin (Tg) or physiologically with the chemotactic peptides fMLF and WKYMVm, ligands of formyl peptide receptors FPR and FPRL1 respectively. In addition, Tg-induced SOCE was modulated by 2-APB, potentiated by MDEB and inhibited by Benzothienyl-APB. The consequences of these analogues on neutrophil functions were also studied. Phagocytosis of yeasts by PLB-985 cells and intraphagosomal ROS production were inhibited by MDEB and Benzothienyl-APB. Furthermore, extracellular ROS were also inhibited by Benzothienyl-APB. However, because of the high interference of MDEB with our techniques, its activities could not be studied. In conclusion, MDEB and Benzothienyl-APB are new analogues of 2-APB potentiating and inhibiting SOCE, which allow us in the future a better understanding of leukocyte SOCE and its cellular roles.PARIS11-SCD-Bib. électronique (914719901) / SudocSudocFranceF

Récepteurs purinergiques et fibrose hépatique

Pour la cinquième année, dans le cadre du module d’enseignement « Physiopathologie de la signalisation » proposé par l’université Paris-sud, les étudiants du Master « Biologie Santé » de l’université Paris-Saclay se sont confrontés à l’écriture scientifique. Ils ont sélectionné une quinzaine d’articles scientifiques récents dans le domaine de la signalisation cellulaire présentant des résultats originaux, via des approches expérimentales variées, sur des thèmes allant des relations hôte-pathogène aux innovations thérapeutiques, en passant par la signalisation hépatique et le métabolisme. Après un travail préparatoire réalisé avec l’équipe pédagogique, les étudiants, organisés en binômes, ont ensuite rédigé, guidés par des chercheurs, une Nouvelle soulignant les résultats majeurs et l’originalité de l’article étudié. Ils ont beaucoup apprécié cette initiation à l’écriture d’articles scientifiques et, comme vous pourrez le lire, se sont investis dans ce travail avec enthousiasme ! Trois de ces Nouvelles sont publiées dans ce numéro, les autres le seront dans des prochains numéros

Antioxidant activity, lymphocytic cell calcium influx modulation and hepatotoxicity evaluation of aqueous Tinospora crispa extracts

International audienc

La galectine-9 favorise la persistance du virus de l’hépatite C dans le foie

Cette année encore, dans le cadre du module d’enseignement « Physiopathologie de la signalisation » proposé par l’université Paris-sud, les étudiants du Master « Biologie Santé » de l’université Paris-Saclay se sont confrontés à l’écriture scientifique. Ils ont sélectionné 12 articles scientifiques récents dans le domaine de la signalisation cellulaire présentant des résultats originaux, via des approches expérimentales variées, sur des thèmes allant des interactions hôte-pathogène au métabolisme, en passant par la compétition cellulaire et le microbiote. Après un travail préparatoire réalisé avec l’équipe pédagogique, les étudiants, organisés en binômes/trinômes, ont ensuite rédigé, guidés par des chercheurs, une Nouvelle soulignant les résultats majeurs et l’originalité de l’article étudié. Ils ont beaucoup apprécié cette initiation à l’écriture d’articles scientifiques et, comme vous pourrez le lire, se sont investis dans ce travail avec enthousiasme