Molecular mechanisms by which low doses of ionizing radiation promote neovascularization in ischemic tissues

Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Biologia Celular e Molecular), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2017Peripheral arterial disease (PAD) is mainly caused by an obstructive artherosclerosis, which results in a mismatch between oxygen supply and demand. Diabetes is an important risk factor for PAD and it is present in almost 50% of the patients with limb ischemia. Critical limb ischemia (CLI) is the end stage of PAD, being characterized by severe obstruction of blood flow to the affected extremity, which results in ischemic rest pain, ulcers or gangrene. Despite substantial evidence of their efficacy in preclinical studies, as well as some promising phase I/II clinical trials, larger randomized clinical trials on angiogenic therapies for CLI have been unsatisfactory. Here, we investigated the ability of low-dose ionizing radiation (LDIR) to stimulate therapeutic neovascularization, in murine models, in a context of hindlimb ischemia (HLI), conjugated or not with diabetes. We demonstrate that 0.3 Gy, administered for four consecutive days, significantly improves blood perfusion in the murine ischemic limb by stimulating angiogenesis and arteriogenesis, as assessed by laser Doppler flow, capillary density and collateral vessel formation. LDIR significantly increased the circulating levels of VEGF, PlGF and G-CSF, as well as the number of circulating endothelial progenitor cells (EPCs), mediating their incorporation into ischemic muscles. These effects were dependent upon LDIR exposition on the ischemic niche (thigh and shank regions). In irradiated ischemic muscles, these effects were independent of the recruitment of monocytes and macrophages. Also, the vasculature in an irradiated non-ischemic bed was not affected and after 52-week LDIR exposure no differences in the incidence of morbidity and mortality were seen. Additionally, in diabetic mice, our data suggest that 0.3 Gy applied during four consecutive days significantly promote blood perfusion, capillary and collateral vessel densities in response to HLI induction. These findings disclose an innovative and non-invasive strategy to induce therapeutic angiogenesis in a murine model of severe HLI, emerging as a novel approach in the treatment of CLI.O sistema circulatório ou cardiovascular é formado pelo coração e vasos sanguíneos e a sua função é levar oxigénio e nutrientes aos órgãos e tecidos do corpo. A doença cardiovascular, de que é exemplo a doença arterial periférica (DAP) é uma das principais causas de mortalidade e morbilidade na população mundial. Estima-se que mais de 25 milhões de pessoas na Europa e nos Estados Unidos apresentem DAP, e a sua incidência tende a aumentar. Importantes fatores de risco para a DAP são a diabetes, tabagismo, hipertensão e dislipidemia. A DAP caracteriza-se por uma obstrução do lúmen arterial, resultando num défice de fluxo sanguíneo aos tecidos cuja principal consequência é a presença de sintomas característicos de isquemia. A manifestação mais frequente de DAP é a claudicação intermitente, que é caracterizada por desconforto muscular no membro inferior, produzido pelo exercício, e que alivia com o repouso. A claudicação tem um impacto negativo na qualidade de vida dos doentes, quer a nível profissional, quer interferindo com as suas atividades sociais. A isquemia crítica dos membros inferiores é a manifestação clínica mais grave da DAP, que descreve doentes com dor em repouso ou com lesões tróficas cutâneas, sejam elas úlceras ou gangrena. Aproximadamente 1% dos doentes com DAP apresentam o estado avançado da doença. As limitações dos procedimentos de revascularização, resultantes da extensão e distribuição anatómica da doença arterial, e do tratamento farmacológico, são bem conhecidas. Assim, a amputação surge como última alternativa terapêutica, apesar das taxas de morbilidade e mortalidade associadas. Na última década vários estudos têm vindo a ser desenvolvidos com o objetivo de encontrar tratamentos alternativos, incluindo a angiogénese terapêutica. A angiogénese terapêutica, a qual pode ser alcançada através da administração local de fatores de crescimento pró-angiogénicos na forma de proteína recombinante ou de células progenitoras endoteliais (CEPs) ou mesmo recorrendo à terapia génica, oferece uma possibilidade de recuperação para estes pacientes. Apesar dos estudos pré clínicos e de alguns ensaios clínicos em fase I/II mostrarem-se bastante promissores, a progressão desses ensaios clínicos para terapias angiogénicas não têm revelado um efeito benéfico em doentes com isquemia crítica dos membros inferiores. Também o pouco conhecimento sobre os agentes angiogénicos envolvidos, nomeadamente a dose, a frequência e o método de administração têm contribuído para o fracasso dos ensaios clínicos. No passado, o nosso grupo de investigação demonstrou que baixas doses de radiação ionizante (BDRI) promovem angiogénese durante o desenvolvimento embrionário e no processo de regeneração da barbatana caudal do peixe zebra. Assim, de acordo com os nossos resultados as BDRI induzem angiogénese in vivo, mas não existe prova de que produzam angiogénese terapêutica em doentes com doença isquémica, sendo este o propósito deste trabalho de doutoramento. Assim, o presente trabalho tem como objetivo: 1) identificar os mecanismos celulares e moleculares pelos quais as BDIR poderão promover angiogénese terapêutica; 2) avaliar se as BDRI promovem a vascularização pós-natal pelo aumento de CEPs em circulação e sua incorporação em locais de neovascularização nos tecidos isquémicos; 3) demonstrar que as BDRI promovem neovascularização num modelo experimental de diabetes. Um modelo animal de isquémia foi desenvolvido usando fêmeas de ratinhos C57BL/6 e recorrendo a várias técnicas de biologia celular e molecular, nomeadamente RT-PCR, imunohistoquímica, imunofluorescência, citometria de fluxo, ELISA, microscopia de microdissecção a laser e diafanização. Neste estudo, após a indução de isquémia unilateral, os ratinhos C57BL/6 foram irradiados ou não com 0.3 Gy, durante quatro dias consecutivos. Os resultados demonstraram que as BDRI, aumentam significativamente a perfusão sanguínea no membro inferior do ratinho sujeito a isquémia, assim como a densidade capilar e a formação de colaterais. Foi também avaliada a vasculatura no membro inferior contralateral que apesar de irradiado não foi sujeito a isquémia. Neste caso particular, nem a densidade capilar, nem a formação de colaterais registaram alterações quando comparadas com animais não irradiados. Estas observações sugerem que em condições não patológicas as BDRI não têm efeito na vascularização. De forma a validar os mecanismos moleculares no nosso modelo isquémico, foram selecionados os melhores candidatos associados a uma resposta pró-angiogénica a partir de uma análise de expressão gênica por microarrays. Os nossos resultados mostraram que a expressão de vários genes pró-angiogénicos nomeadamente, Vegfr2, Vegfr1, Fgf2, Angpt2, Pdgfc, Tgfb2, Hgf e Met está induzida em células endoteliais isoladas de músculos de ratinhos sujeitos a isquémia e comparadas com a expressão em células endoteliais isoladas dos músculos não isquémicos contralaterais. Desta forma, as BDRI sugerem conferir uma resposta pró-angiogénica após indução de isquémia. Neste trabalho foi também demonstrado que as BDRI aumentam significativamente tanto a concentração de VEGF, PIGF e G-CSF como de CEPs em circulação e medeiam a incorporação destas células nos músculos isquémicos. Este trabalho revela ainda que não existe diferença de morbilidade nem de mortalidade em ratinhos irradiados quando comparados com ratinhos não irradiados, sendo eles acompanhados durante 52 semanas após exposição a BDRI. Para complementar este trabalho e sendo a diabetes um importante fator de risco no contexto da DAP, foi observado que em resposta à indução de isquémia as BDRI, administradas durante quatro dias consecutivos, aumentam significativamente a perfusão sanguínea, a densidade capilar e a formação de colaterais num modelo experimental diabético. No entanto estes dados resultam de um estudo preliminar, sendo crucial o aumento do número de animais. Em conclusão, o presente trabalho demonstra que BDIR induzem angiogénese terapêutica num modelo experimental de isquémia do membro inferior. Este trabalho é relevante pois propõe o uso de BDIR como uma estratégia inovadora e não invasiva no tratamento da isquémia crítica do membro inferior