Untersuchung zur Funktion und Bedeutung der ABC-Transporter in Drosophila melanogaster

Die vorliegende Dissertation befasst sich mit Analysen zur Funktion und Bedeutung der ABC-Transporter in der Taufliege Drosophila melanogaster. Dazu wurden die Aufgaben dieser Proteine in der Augenpigmentierung, im Vitamintransport und im Lipidmetabolismus genauer charakterisiert. Außerdem wurden Enzyme und Proteine, die an der Pigmentierung der Komplexaugen beteiligt sind, analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass die ABC-Transporter White (W), Scarlet (St) und Brown (Bw) in subzellulären Kompartimenten der Malpighischen Gefäße von Drosophila melanogaster lokalisiert sind. Dort sind die Proteine funktionell voneinander abhängig, denn für die Stabilisierung und Integration in die Membran der intrazellulären Vesikel wird ein Dimerisierungspartner benötigt. Analog zum Komplexauge existieren in den Malpighischen Gefäßen die Heterodimere W/St und W/Bw. Eine bisher noch nicht beschriebene Funktion von W/Bw in den Exkretionsorganen ist der aktive Transport des essentiellen Vitamins Riboflavin zur intrazellulären Speicherung, woran auch W/St partiell beteiligt ist. Offensichtlich ist diese Akkumulierung unter Laborkonditionen nicht wichtig für das Überleben der Taufliege. Solange durch die Nahrungsquelle genügend Riboflavin zur Verfügung steht, sind auch entsprechende Mutanten ausreichend versorgt. ABCG2, ein humanes Homolog von Drosophila White, das ebenfalls als Riboflavin-Transporter beschrieben wurde, ist weder im Komplexauge noch in den Malpighischen Gefäßen in der Lage, die Funktion von White zu übernehmen. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde erstmals eine detaillierte Untersuchung von Lipidgehalt und -verteilung in Drosophila melanogaster vorgenommen. Durch die Verwendung der drei Methoden Dünnschichtchromatographie, Gaschromatographie und Massenspektrometrie konnten Neutrallipide, Phospholipide und die Verteilung der Fettsäuren dargestellt werden. Zahlreiche Lipidanalysen zeigen, dass das Lipidmuster in Drosophila durch unterschiedliche Faktoren beeinflusst wird. Von besonderer Bedeutung sind die unerwartete Variabilität in Wildtypstämmen und der Einfluss des ABC-Transporters White, welcher bei der Verwendung des UAS-GAL4-Systems fehlexprimiert wird. Daher ist es wichtig, die erhaltenen Ergebnisse durch mehrere experimentelle Ansätze zu überprüfen, um sie richtig interpretieren zu können. Zu beachten ist, dass ein reduzierter Lipidgehalt das Verhalten von Drosophila in vielen Experimenten beeinflussen kann, auch wenn es sich dabei aufgrund von unterschiedlicher genetischer Herkunft der Mutanten möglicherweise nicht um einen Phänotyp handelt. Diese Beobachtungen verdeutlichen, wie wichtig die Auswahl der richtigen Kontrollen in der Forschung ist. Innerhalb dieser Lipidanalysen konnten sowohl in zahlreichen Augenpigmentierungsmutanten als auch bei den knock-downs von ABCA- und ABCG-Transportern interessante Phänotypen festgestellt werden. Mutationen in einzelnen Untereinheiten des AP-3-Komplexes haben beispielsweise einen drastischen Effekt auf den Protein- und Lipidgehalt. Auch Mitglieder der ABC-Transporter, die, wie ihre humanen Homologe, den Lipidmetabolismus direkt oder indirekt beeinflussen, konnten in Drosophila identifiziert werden. Beispiele hierfür sind white und Atet sowie bisher noch nicht genauer charakterisierte Gene wie CG3164 und CG9664. Hier sind jedoch weitere Untersuchungen notwendig, um deren Funktion im Lipidstoffwechsel verstehen zu können

Altered lipid metabolism in a Drosophila model of Friedreich’s ataxia

Producción CientíficaFriedreich’s ataxia (FRDA) is the most common form of autosomal recessive ataxia caused by a deficit in the mitochondrial protein frataxin. Although demyelination is a common symptom in FRDA patients, no multicellular model has yet been developed to study the involvement of glial cells in FRDA. Using the recently established RNAi lines for targeted suppression of frataxin in Drosophila, we were able to study the effects of general versus glial-specific frataxin downregulation. In particular, we wanted to study the interplay between lowered frataxin content, lipid accumulation and peroxidation and the consequences of these effects on the sensitivity to oxidative stress and fly fitness. Interestingly, ubiquitous frataxin reduction leads to an increase in fatty acids catalyzing an enhancement of lipid peroxidation levels, elevating the intracellular toxic potential. Specific loss of frataxin in glial cells triggers a similar phenotype which can be visualized by accumulating lipid droplets in glial cells. This phenotype is associated with a reduced lifespan, an increased sensitivity to oxidative insult, neurodegenerative effects and a serious impairment of locomotor activity. These symptoms fit very well with our observation of an increase in intracellular toxicity by lipid peroxides. Interestingly, co-expression of a Drosophila apolipoprotein D ortholog (glial lazarillo) has a strong protective effect in our frataxin models, mainly by controlling the level of lipid peroxidation. Our results clearly support a strong involvement of glial cells and lipid peroxidation in the generation of FRDA-like symptoms.2015-09-1

Effects of external radiation in a co-culture model of endothelial cells and adipose-derived stem cells

BACKGROUND: The inflammatory response clinically observed after radiation has been described to correlate with elevated expression of cytokines and adhesion molecules by endothelial cells. Therapeutic compensation for this microvascular compromise could be an important approach in the treatment of irradiated wounds. Clinical reports describe the potential of adipose-derived stem cells to enhance wound healing, but the underlying cellular mechanisms remain largely unclear. METHODS: Human dermal microvascular endothelial cells (HDMEC) and human adipose-derived stem cells (ASC) were cultured in a co-culture setting and irradiated with sequential doses of 2 to 12 Gy. Cell count was determined 48 h after radiation using a semi-automated cell counting system. Levels of interleukin-6 (IL-6), basic fibroblast growth factor (FGF), intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) were determined in the supernatants using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Irradiated HDMEC and ASC as well as non-irradiated co-cultures, HDMEC or ASC respectively were used as controls. RESULTS: Cell count was significantly reduced in irradiated co-cultures of HDMEC and ASC compared to non-irradiated controls. Levels of IL-6, FGF, ICAM-1 and VCAM-1 in the supernatants of the co-cultures were significantly less affected by external radiation in comparison to HDMEC. CONCLUSION: The increased expression of cytokines and adhesion molecules by HDMEC after external radiation is mitigated in the co-culture setting with ASC. These in vitro changes seem to support the clinical observation that ASC may have a stabilizing effect when injected into irradiated wounds

Wound healing after radiation therapy: Review of the literature

Radiation therapy is an established modality in the treatment of head and neck cancer patients. Compromised wound healing in irradiated tissues is a common and challenging clinical problem. The pathophysiology and underlying cellular mechanisms including the complex interaction of cytokines and growth factors are still not understood completely. In this review, the current state of research regarding the pathomechanisms of compromised wound healing in irradiated tissues is presented. Current and possible future treatment strategies are critically reviewed