Comparison of HLA-Class-I-antigenpresentation and geneexpression

In der vorliegenden Arbeit wurden aus zwei Nierenzellkarzinomen und zwei Kolonkarzinomen nach MHC-Klasse-I-Immunpräzipitation insgesamt 38 HLA-Klasse-I-gebundene Peptide massenspektrometrisch identifiziert. Zusätzlich wurde mit Hilfe von DNA-Chip-Technologie, quantitativer PCR und Laser Capture-Mikroskopie eine Expressionsanalyse eines Nierenzellkarzinoms durchgeführt und deren Ergebnisse mit den identifizierten HLA-Klasse-I-Liganden des selben Karzinoms vergleichen. So wurde die Expression im Tumorgewebe gegenüber dem Normalgewebe der gleichen Niere für ca. 7000 Gene überprüft. Verglichen mit den 22 gefundenen HLA-Klasse-I-Liganden des Nierenzellkarzinoms zeigte sich, daß sieben der den Peptiden zugehörigen Antigene im Tumor überexprimiert waren. Darunter waren u.a. die Nicotinamide-N-Methyltransferase (NNMT) (YYMIGEQKF) und das Protoonkogen c-Met (YVDPVITSI). Für sie konnte mittels quantitativer PCR von RNA verschiedener Körpergewebe nachgewiesen werden, daß ihre Expression - mit Ausnahme der Leber für NNMT - auf die Tumoren beschränkt ist bzw. sie dort stark überexprimiert sind. Somit wird angenommen, daß diese beiden Peptide mögliche Kandidaten für eine Tumorvakzinierung sind. Des weiteren wurde im untersuchten Nierenzellkarzinom ein Peptid eines vermeintlichen Frameshift-Proteins gefunden, für das die Nukleotidsequenz317-343 des DEAD/H box 3-Gens kodiert. Ob es sich dabei um ein tumorspezifisches Phänomen handelt, ist bis jetzt noch unklar. Für die restlichen Antigene der gefundenen Peptide konnte keine Überexpression in Tumoren nachgewiesen werden oder es war eine weite Verbreitung in normalen Körpergeweben offensichtlich oder unklar. Durch Einführung einer neuen MHC-Klasse-I-Immunpräzipitationsmethode mit Protein A-Sepharose wurde die Peptidausbeute bis auf das vierfache gesteigert. Es ist anzunehmen, daß der hier dargestellte Ansatz der Kombination von DNA-Expressionsanalyse und HLA-Klasse-I-Ligandenidentifikation und die daraus resultierende Möglichkeit des patientenspezifischen Vakzins die Tumorimmuntherapie entscheidend verbessern kann.In total 38 HLA-Class-I-bound peptides have been identified after MHC-Class-I-immunoprecepitation and mass-spectrometry from two renal cell carcinomas and two colon carcinomas. In addition gene-expression analysis of one renal cell carcinoma has been performed by DNA-microarray-technology, quantitative PCR and laser capture microscopy. The results of this expression analysis have been compared with identified MHC-Class-I-ligands of the same carcinoma. About 7000 Genes have been examined for expression in tumor-tissue and corresponding normal tissue of the same kidney. Compared with 22 HLA-Class-I-ligands identified from a renal cell carcinoma it could be shown that seven of the identified peptides have been overexpressed in tumor-tissue. For example peptides of Nicotine-N-Methyltransferase (NNMT) (YYMIGEQKF) and of the protooncogene c-Met (YVDPVITSI) have been identified. By quantitative PCR of different body-tissues we could show that expression of the corresponding genes was restricted to or overexpressed in tumor-tissue, exept NNMT, which was also expressed in normal liver-tissue. It has been concluded, that the two peptides could be potential candidates for tumor-vaccination. In the exmamined renal cell carcinoma a peptide of a potenial frameshift protein has been identified for which the DEAD/H box 3-Gene is coding. If this is a tumor-specific phenomenon is not clear. Other antigens, from which peptides have been identified did not show overexpression in tumor-tissue or were expressed in other normal tissue or their expression pattern has not yet examined. By a new MHC-Class-I-immunoprecipitation-technique a four time higher peptide-yield could be achived. In conclusion, the combination of DNA-expression analysis and HLA-Class-I-ligand-identification and the resulting possibility of tailoring patient specific vaccines could improve tumor-immunotherapy significantly

Wnt Receptor Frizzled-4 as a Marker for Isolation of Enteric Neural Progenitors in Human Children

Identification and isolation of neural progenitor cells from the human enteric nervous system (ENS) is currently hampered by the lack of reliable, specific markers. Here, we define the Wnt-receptor frizzled-4 as a marker for the isolation of enteric neural progenitor cells derived from paediatric gut samples. We show that the Wnt-receptor frizzled-4 is expressed in the human colon and in Tunica muscularis-derived enterospheres. To obtain a purified culture, we carried out fluorescence-activated cell sorting (FACS) using PE-conjugated frizzled-4 antibodies. Frizzled-4positive cells gave rise to neurosphere-like bodies and ultimately differentiated into neurons as revealed by BrdU-proliferation assays and immunocytochemistry, whereas in frizzled-4negative cultures we did not detect any neuronal and glial cells. By using a patch-clamp approach, we also demonstrated the expression of functional sodium and potassium channels in frizzled-4positive cell cultures after differentiation in vitro