Mechanisms of PTPσ-Mediated Presynaptic Differentiation

Formation of synapses between neurons depends in part on binding between axonal and dendritic cell surface synaptic organizing proteins, which recruit components of the developing presynaptic and postsynaptic specializations. One of these presynaptic organizing molecules is protein tyrosine phosphatase σ (PTPσ). Although the protein domains involved in adhesion between PTPσ and its postsynaptic binding partners are known, the mechanisms by which it signals into the presynaptic neuron to recruit synaptic vesicles and other necessary components for regulated transmitter release are not well understood. One attractive candidate to mediate this function is liprin-α, a scaffolding protein with well-established roles at the synapse. We systematically mutated residues of the PTPσ intracellular region (ICR) and used the yeast dihydrofolate reductase (DHFR) protein complementation assay to screen for disrupted interactions between these mutant forms of PTPσ and its various binding partners. Using a molecular replacement strategy, we show that disrupting the interaction between PTPσ and liprin-α, but not between PTPσ and itself or another binding partner, caskin, abolishes presynaptic differentiation. Furthermore, phosphatase activity of PTPσ and binding to extracellular heparan sulfate (HS) proteoglycans are dispensable for presynaptic induction. Previous reports have suggested that binding between PTPσ and liprin-α is mediated by the PTPσ membrane-distal phosphatase-like domain. However, we provide evidence here that both of the PTPσ phosphatase-like domains mediate binding to liprin-α and are required for PTPσ-mediated presynaptic differentiation. These findings further our understanding of the mechanistic basis by which PTPσ acts as a presynaptic organizer

Das Saccharomyces cerevisiae HtrA Ortholog, Ynm3, ist eine Chaperon-Protease, die für das Überleben unter Hitzestress verantwortlich ist

Ynm3 ist das einzige Protein der Bäckerhefe, das eine Kombination von Serin Protease und PDZ Domänen, ein die hoch konservierte HtrA2 Proteinfamilie definierendes Merkmal, besitzt. Das Bakterielle HtrA2/DegP ist in die schützende Stressantwort involviert und hilft beim Überleben höherer Temperaturen, indem es irreversibel ungefaltete Proteine im Periplasma zerschneidet. Bei normalen Temperaturen hilft es als Chaperon bei der Reifung äußerer Membranproteine welche der Faltung durch das periplasmatische SurA entgangen sind. Überexpressionsstudien in Zellkulturen mit mitochondrialen HtrA2/Omi von Säugern weisen auf eine proapoptosche Rolle dieses Proteins hin. Mäuse ohne HtrA2/Omi zeigen jedoch keine reduzierte Zelltodrate. Stattdessen leiden sie an einem Verlust von Neuronen im Striatum, welcher zu einem Parkinson ähnlichem Phänotyp führt. Für das humane HtrA2/Omi konnten zwei Allele mit einem teilweisen Verlust der Proteaseaktivität als Faktoren in der Entstehung von Parkinson identifiziert werden. Daher scheint es eher, dass Säuger HtrA2/Omi, welches im Intermembranraum von Mitochondrien lokalisiert ist, eine die Zelle schützende Rolle spielt. Die Hypothese, dass auch hier HtrA2/Omi wie sein bakterielles Gegenstück als Chaperon-Protease wirkt ist sehr attraktiv, wenn man in Betracht zieht, dass Mitochondrien von frühen α-Proteobakterien abstammen. Bisher wurde jedoch keine solche Funktion in einem Eukarionten beschrieben. Diese Arbeit untersucht nun die zelluläre Rolle von Ynm3, dem HtrA2 Ortholog von Saccharomyces cerevisiae, einem einfachen einzelligen eukariontischen Modelorganismus.Das haupsächliche Ergebnis dieser Arbeit ist nun, dass Ynm3, wie das HtrA/DegP aus E. coli, wirklich eine Chaperon-Protease ist. Die proteolytische Aktivität von Ynm3 mit dem katalytischen Serin an Position 236 ist wichtig für seine schützende rolle bei Temperaturstress. Außerdem konnte erstmalig für ein Mitglied der eukariontischen HtrA Familie eine generelle ATP-unabhängige Chaperonaktivität in vitro gezeigt werden. Diese Chaperonaktivität von Ynm3 könnte für die Effizienz der Proteolyse wichtig sein, indem sie die Formation von nicht prozessierbaren toxischen Aggregaten verhindert und die Subsrate in löslicher Form der Proteasedomäne zuführt. Wie bei dem klassischem proteolytischen Komplex von Bakterien und Mitochondrien könnte die Chaperonaktivität von Ynm3 für den Abbau von Proteinen wichtig sein, die ungefaltet geschnitten werden müssen, da sie sonst keinen Zugang zum katalytischem Zentrum finden.Ein Suppressorscreen in dieser Arbeit identifizierte Fpr3, eine nukleolare Peptidyl Prolyl cis-trans Isomerase (PPIase) als Suppressor der Thermosensitivität von Δynm3. Weitere Analysen zeigten eine starke Chaperonaktivität von Fpr3 in vitro. Auch hier existiert ein bakterielles Gegenstück, das periplasmatische Chaperon SurA, welches durch das bakterielle HtrA/DegP teilweise ersetzt werden kann. Die beobachtete Interaktion von Ynm3 mit der PPIase Fpr3 unterstützt zusätzlich die Hypothese, dass Ynm3, als eukariontisches Mitglied der HtrA Familie, eine Rolle in der Protein Qualitätskontrolle analog zu der von bakteriellem HtrA/DegP spielt.Ynm3 ist hauptsächlich nuklear lokalisiert, jedoch konnte in alten Zellen eine Subpopulation assoziiert mit Mitochondrien gefunden werden. Ynm3 könnte also auch eine Rolle für die mitochondriale Homeostase wärend des Alterns spielen. Die Bäckerhefe wurde bislang schon oft erfolgreich genutzt um molekulare Mechanismen von humanen, auch neurodegenerativen, Krankheiten zu verstehen. Daher könnte auch diese Arbeit signifikant zum Verständnis der Rolle von HtrA2/Omi, besonders im Hinblick auf die Protein Qualitätskontrolle, bei der Entstehung von Parkinson beitragen

Lacrimal Proline Rich 4 (LPRR4) Protein in the Tear Fluid Is a Potential Biomarker of Dry Eye Syndrome

<div><p>Dry eye syndrome (DES) is a complex, multifactorial, immune-associated disorder of the tear and ocular surface. DES with a high prevalence world over needs identification of potential biomarkers so as to understand not only the disease mechanism but also to identify drug targets. In this study we looked for differentially expressed proteins in tear samples of DES to arrive at characteristic biomarkers. As part of a prospective case-control study, tear specimen were collected using Schirmer strips from 129 dry eye cases and 73 age matched controls. 2D electrophoresis (2DE) and Differential gel electrophoresis (DIGE) was done to identify differentially expressed proteins. One of the differentially expressed protein in DES is lacrimal proline rich 4 protein (LPRR4). LPRR4 protein expression was quantified by enzyme immune sorbent assay (ELISA). LPRR4 was down regulated significantly in all types of dry eye cases, correlating with the disease severity as measured by clinical investigations. Further characterization of the protein is required to assess its therapeutic potential in DES.</p> </div

mRNA expression of LPRR4 in human lacrimal gland tissue as 144 bp product using RT-PCR showing tissue specificity for LPRR4.

<p>Lane 1∶100 and 200 bp ladder, Lane 2: Negative control (except cDNA), Lane 3–6: human lacrimal gland tissue (2 µg), Lane 7–8: human corneal epithelial tissue ((2 µg).</p

Differentially expressed tear proteins identified by LC-MS/MS.

*<p>From literature.</p><p>Tear proteins were profiled by 2D electrophoresis. A total of 56 peptides showed differential expression. 30 peptide spots corresponding to 6 proteins namely, lacrimal proline rich 4 protein (LPRR4), immunoglobulin J, cystatin, Zinc alpha glycoprotein, lacritin precursor, extracellular glycoprotein lacritin precursor, lactotransferrin isoform 1 and 2, mammaglobulin B precursor. The rest of the spots are not yet identified.</p

Down regulation of LPRR 4 protein in various types of DES cases as determined by 2D electrophoresis and PDQuest analysis.

<p>Down regulation of LPRR 4 protein in various types of DES cases as determined by 2D electrophoresis and PDQuest analysis.</p

Pearson’s Correlation graph of LPRR4 levels in Dry eye syndrome with clinical parameters namely Schirmer’s value and Tear Breakup Time (TBUT).

<p>A. Tear LPRR4 levels vs Schirmer value (<i>p = 0.008),</i> B. Tear LPRR4 levels vs TBUT. (<i>p = 0.005</i>).</p