造血障害性Tリンパ球の標的となる造血幹細胞抗原の同定

金沢大学医学部研究課題/領域番号:04772080, 研究期間(年度):1992出典：研究課題「造血障害性Tリンパ球の標的となる造血幹細胞抗原の同定」課題番号04772080（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-04772080/）を加工して作

自己免疫性再生不良性貧血における自己抗原の解析: CD4陽性T細胞エピトープの同定

金沢大学大学院・医学系研究科再生不良性貧血の免疫病態に密接に関与するCD4陽性T細胞クローンZN1のエピトープを同定するため、Herpesvirus saimiri感染により不死化したZN1の標的細胞をスクリーニングしたところ、造血因子の存在下で1週間培養した自己骨髄単核細胞が、ZN1の有意な増殖を促すことが示された。この患者が持つHLAクラスII遺伝子のうち、どの分子が抗原提示に関わっているかを決定するため、ZN1にX線照射した培養自己骨髄単核細胞を加える際に、抗HLA-DR抗体、抗HLA-DQ抗体、または抗HLA-DR2抗体を加えたところ、抗DR抗体または抗DR2抗体を加えた時にのみNT1の増殖反応が抑制された。そこで、CLIP置換型Ii鎖遺伝子発現ベクターに由来するペプチドをHLA-DR2に提示させるため、COS-7細胞にDR2β鎖プラスミドとDR2α鎖プラスミドをトランスフェクトしたところ、抗DR2抗体で認識されるDR2分子の発現が確認された。現在、ペプチドライブラリーをこのCOS7トランスフェクタントに導入し、NT1によるスクリーニングを行っている。一方,同じ患者の自己抗体によって認識される造血幹細胞上の自己抗原をSEREX法によってスクリーニングしたところ、αグロビンペプチド(αグロビン^)が同定された。このペプチドとGSTとのfusion蛋白に対する抗体は再生不良性貧血患者25例中21例に検出された。このペプチドにより刺激された患者末梢血単核細胞中には、αグロビン^に特異的なCD8陽性T細胞が0.55%含まれていた。さらに、この培養T細胞は自己の造血前駆細胞由来コロニーを、CFU-GMで対照の43%、BFU-Eコロニーで50%に減少させた。以上の所見から、αグロビンは再生不良性貧血における自己抗原の一つであると考えられた。To determine an epitope of a CD4^+ T-cell clone, ZN1, that appears to have an essential role in the development of aplastic anemia, we attempted to establish a system to screen a peptide capable of stimulating this T-cell clone using CLIP-replacement Ii-chain gene expression vectors. ZN1 was immortalized using infection with Herpesvirus saimiri. Stimulation with cultured bone marrow mononuclear cells (BMMCs) in the presence of IL-3 and GM-CSF induced DNA synthesis by ZN1. When monoclonal antibodies (mAbs) against HLA-DR, HLA-DR2 or HLA-DQ were added to the culture, both anti-DR and anti-DR2 mAbs inhibited DNA synthesis by ZN1 in response to cultured BMMCs, suggesting restriction ** antigen recognition by HLA-DR2. Then, we transfected COS7 cells with a DR2 b gene plasmid and a DR a chain plasmid. Flow cytometry confirmed expression of DR2 by the COS7 transfectant. We are now testing interferon-γ excretion by ZN1 stimulated by the HLA-DR2-COS7 that was transfected with CLIP-replacement Ii chain gene vectors.In relation to this project, we screened cDNA library derived from the patient\u27s bone marrow mononuclear cells using serological identification of antigens by recombinant expression cloning to identify autoantigens in AA. IgG antibodies recognizing α globin (residue 1-101, α globin^) was detected in the patient\u27s serum. Immunoblotting using recombinant α globin^ detected the specific antibodies in 21 of 25 (84.0%) AA patients. When the patient\u27s lymphocytes were stimulated with α globin^, a low percentage of CD8* T cells reactive to this peptide were generated. The cultured T cells showed cytotoxicity against HLA-A*0201^+JY cells that were pulsed with this peptide. Addition of T cells stimulated by α globin^ to autologous CD34^+ cells reduced the number of colonies derived from BFU-E and CFU-GM to nearly a half of the control, α globin may serve as a target of immune system attack in AA patients possessing HLA-A-*0201.研究課題/領域番号:13470202, 研究期間(年度):2001 – 2002出典：「自己免疫性再生不良性貧血における自己抗原の解析-CD4陽性T細胞エピトープの同定-」研究成果報告書　課題番号13470202（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-13470202/134702022002kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/)を加工して作

再生不良性貧血の病因としての heat shock protein 70 の解析

金沢大学医学部附属病院免疫抑制療法を受けた多数の再生不良性貧血症例について,末梢血リンパ球におけるheat shock protein(hsp72)の発現をフローサイトメトリーで検討した.その結果,シクロスポリン療法に反応して改善した再生不良性貧血患者のリンパ球では,熱ショック後のhsp72の発現が亢進していることが明らかになった.この現象は,再生不良性貧血以外の血液疾患患者ではみられなかった.hsp72の発現はTリンパ球においてとくに顕著であった.したがって,治療前に末梢血リンパ球のhsp72の誘導性を調べることは,シクロスポリンのような免疫抑制剤に対する反応性を予測する上で有用と考えられた.一方,全国の症例について調査を行ったところ,再生不良性貧血全体の約40%の症例で,末梢血単核細胞中のhsp72陽性細胞の割合が高値(>30%)を示した.しかし,抗胸腺細胞グロブリン+シクロスポリン療法の効果との関係をみたところ,シクロスポリン療法でみられたような明らかな相関は認められなかった.一部の再生不良性貧血患者では,リンパ球だけでなく,赤血球の表面にもhsp72が検出された.そこで,赤血球表面のhsp72について詳細に検討したところ,hsp72は,再生不良性貧血患者だけでなく,約30%の健常人で20〜90%の赤血球表面に発現していた.血液型との関係を調べたところ,hsp72はA型とAB型の赤血球にのみ検出された.hsp72の発現は熱ストレスとは無関係であった.hsp72陽性の健常人の骨髄をin vitroで培養し,赤血球前駆細胞を分化させたところ,得られた赤芽球の表面にはhsp72は検出されなかった.このためhsp72は,A型およびAB型の赤芽球が脱核したのちに赤血球表面に発現すると思われた.赤血球表面にはhsp72だけでなく,hsp90の発現も認められた.A型物質との関係を調べるため,O型赤血球をNアセチルガラクトサミン(GalNAc)トランスフェラーゼとUDP-GalNAcで処理することによりA血球に変換したところ,抗hsp72抗体との反応はみられなかった.したがって,赤血球表面のhsp72の発現は,遺伝的に決定されたものであり,A型物質の発現と密接な関係にあることが示唆された.To characterize immune pathophysiology of aplastic anemia (AA), we studied expression of heat shock piotein (-hsp) 72 in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of untreated AA patients using flow cytometry. AA patients whose PBMCs exhibited high percentages (>30%) of hsp72+ cells after heat treatment were likely to respond to cyclosporine therapy. The high inducibility of hsp72 in PBMCs was not detected in other hematologic diseases, such as myelodysplastic syndrome and hemolytic anemia. Among PBMCs of AA patients responsive to cyclosporine, hsp72 expression was primarily detected in T cells. Thus, detection of hsp72^+ cell in PBMCs before treatments appeared to be useful for predicting a favorable response to cyclosporine therapy. Next, we collected PBMCs of AA patients who later received combined immunosuppressive therapy consisting of antithymocyte globulin and cyclosporine from the other hospitals in Japan, and determined the inducibility of hsp72. Although approximately 40% of patients showed high percentages of hsp72^+ cell among PBMCs, there was no correlation between a good response to the combined immunosuppressive therapy and a high inducibility of hsp72 in PBMCs.In some AA patients, hsp72 was detectable not only in the cytoplasm of PBMCs but also on the surface of red blood cells (RB Cs). Detailed analysis of hsp72 on RBCs revealed that in additi9n to AA patients, hsp72^+ cells could be detected on 20-90% of RBCs of about 30% of normal individuals and that its expression was restricted to individuals bearing blood type A and AB.Heat treatments did not influence the expression of hsp72 on RB Cs. Since hsp72 could not be detected on normocytic erythroblasts that were generated from erythroid progenitor cells of a normal individual with blood type A, hsp72 appeared to emerge on RBCs after terminal differentiation of erythroid progenitor cells. Beside hsp72, RBCs of individuals with blood type A and AB expressed hsp90. Binding of anti-hsp72 monoclonal antibodies was not seen in type O RBCs that were forced to express A antigens by the treatment with N-acetyl galactosaminyltransferase and UDP-N-acefyl galactosamine. Thus, the expression of hsp72 seemed to be genetically determined although it is closely associated with A antigen expression. The function and biological significance of hsp72 on RBCs remain to be determined.研究課題/領域番号:09671103, 研究期間(年度):1997 – 1998出典：研究課題「再生不良性貧血の病因としての heat shock protein 70 の解析 」課題番号09671103（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-09671103/096711031998kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/）を加工して作

再生不良性貧血に対するサイクロスポリンの作用機序の解明

金沢大学医学部研究課題/領域番号:03771854, 研究期間(年度):1991出典：研究課題「再生不良性貧血に対するサイクロスポリンの作用機序の解明」課題番号03771854（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-03771854/）を加工して作

自己抗体による免疫担当細胞からのサイトカイン分泌増強を介した骨髄不全病態の解析

金沢大学医学系平成20年度までの研究により、骨髄不全患者血清から精製した抗モエシンポリクローナル抗体が、単球が発現しているモエシンに結合し、ERK1/2を活性化することによってTNF-αの分泌を誘導することが明らかになった。この結果から、免疫担当細胞が発現しているモエシン蛋白が造血調節に関わっている可能性が示唆された。そこで、モエシン分子がin vivo造血にどのように関与しているかを明らかにするため、大阪大学月田研究室から供与されたモエシンノックアウト(KO)マウス胚を用いてこのマウスを生育させ、まず造血状態を評価した。その結果、野生型マウス(n=9)では白血球数が13453±4114/μLであったのに対し、モエシンKOマウス(n=10)では白血球数が3965±1565/μLと、野生型マウスに比べて有意に低値P<0.05)であった。モエシンKOマウスにおける白血球減少のメカニズムについては現在検討中である。また、このKOマウスを精製マウスモエシン蛋白で免疫することにより抗マウスモエシンモノクローナル抗体を作製し、抗モエシン抗体が野生型マウスのin vivo造血に及ぼす影響を検討する予定である。また、肝炎後再生不良性貧血(肝炎後再不貧)における自己抗原を同定するため、肝炎後再不貧患者血清中の自己抗体を、肝細胞株Huh7の培養上清由来蛋白とウェスタンブロッティングを用いてスクリーニングした。その結果、肝炎後再不貧患者7例中4例(57%)の患者血清IgGが培養上清中の約70kDaの蛋白に対して反応した。そこで、この70kDaバンドを切り出して質量分析にかけたところ、この蛋白はHSP72であることが判明した。精製HSP72蛋白質とウェスタンブロッティングを用いて他の患者血清中の抗HSP72抗体を調べたところ、肝炎後再不貧12例中8例(67%)が陽性であったのに対し、自己免疫性肝炎4例、BもしくはC型肝炎5例ではすべて陰性であり、健常者29例中2例の陽性率は高々7%であった。以上の結果から、HSP72は肝炎後再不貧における自己抗原の一つと考えられた。研究課題/領域番号:19659243, 研究期間(年度):2007 – 2008出典：研究課題「自己抗体による免疫担当細胞からのサイトカイン分泌増強を介した骨髄不全病態の解析」課題番号19659243（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-19659243/）を加工して作

PIG-A遺伝子変異をマーカーとしたヒト造血幹細胞動態の解明

金沢大学医学系ヒト造血幹細胞の分化経路を明らかにすうため、多数の骨髄不全症例について、多血球系統におけるCD55-CD59-CD48-血球の観察を続けた。その結果、PMH形質の血球は、症例によって異なる、限られた血球系統の組み合わせを維持しながら、年余に渡って造血を支持し続けることが明らかになった。このように長期間造血を維持するという造血幹細胞としての性質を持ちながら、限られた系統にだけしか分化できない、という矛盾を説明するため、理化学研究所(横浜)の河本宏博士、中茎隆博士との共同研究により、ヒト骨髄における造血環境のモデルを作成した。これは、ヒト骨髄組織には、赤血球系、顆粒球・単球系、Tリンパ球、Bリンパ球のそれぞれの分化だけを支持する異なろ領域がモザイク状に重なって存在しており、どの領域に造血幹細胞が位置するかによって、その幹細胞から産生され続ける血球の系統が決定されるというものである。この仮説が正しいかどうかを検証するため、各血球系統の造血の場の広さ、位置、数を変数とし、バーチャルな造血モデルを作成したところ、ある条件下では、実際に観察された16種類の異なる血球系統の組み合わせハターンに近似した血球産生ハターンを再現できることが明らかになった。この結果はまもなく投稿予定である。このモデルを証明するためには、ヒト生体内において分化系統が限られている患者のPIG-A変異幹細胞が、免疫不全マウスでは全血球系統に分化しうることを示す必要がある。これまでの検討により、PNH形質の血球分化の系統が限られていながら、PNH型顆粒球の割合が3%を超える症例を数名同定している。今後倫理審査での承認と患者の同意が得られれば、理化学研究所(横浜)石川文彦博士との共同研究により、本検討を実施する予定である。一方、骨髄不全患者における微少PNH型血球を検出する方法として、昨年来検討してきた、液状fluorescent-labeled inactive toxin aerolysin(FLAER)とFACSCantoを用いる新たなPNH型検出方法は、技術移管が可能なレベルまでアッセイが確立されたたため、2010年12月10日特許を出願した(特願2010-275878)。研究課題/領域番号:21659236, 研究期間(年度):2009 – 2010出典：研究課題「PIG-A遺伝子変異をマーカーとしたヒト造血幹細胞動態の解明」課題番号21659236（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-21659236/）を加工して作

抗原特異的T細胞のクロノタイプ解析を利用した新規マイナー組織適合抗原の同定

金沢大学医薬保健研究域医学系平成14年末にドナーリンパ球輸注(DLI)を行った慢性骨髄性白血病患者について、抗原特異的なT細胞の増殖の有無を調べたところ、これまでの4例と同様に、DLI後8週の末梢血においてBV11陽性T細胞クローンの一過性増殖が認められた。このT細胞はCD4陽性であった。このT細胞がDLIによって患者に移入されたものか、あるいは元々患者の流血中に存在していたものかを明らかにするため、T細胞クロノタイプ特異的なreal-time PCRを用いてT細胞の定量を試みている。一方、この患者のBV11陽性T細胞クローンについては、類似のクロノタイプを持つ既知のT細胞クローンを見出し得なかったため、以前の研究で同定した多型接着分子がマイナー組織適合抗原(minor histocompatibility antigen, mHa)として機能するか否かを検討した。平成14年度の研究により、多型接着分子の一つCD62LがGVHD方向に不一致である場合に限り、白血病の再発率が有意に低下することが明らかとなった。症例を追加した本年度の研究により、HLA-A24陽性例のみを対象とした解析でも同様の結果が得られた。そこで、CD62Lの多型部位を含む9種類のペプチドを作成し、GVHD方向に不一致を示すHLA-A24陽性患者5例の移植後T細胞を、ペプチドでパルスした樹状細泡で刺激したところ、一部のペプチドがインターフェロン産生を誘導した。また、そのペプチドの一つCD62L^を用いて骨髄T細胞を繰り返し刺激したところ、ペプチド特異的な細胞傷害活性を有するCD8陽性T細胞株が樹立できた。このペプチドとHLA-A24によるテトラマーを作製したところ、ペプチド特異的なCD8陽性T細胞の中にテトラマー陽性細胞が検出された。以上から、CD62L^はHLA-24拘束性のmHaとして機能している可能性が示された。研究課題/領域番号:14657243, 研究期間(年度):2002 – 2003出典：「抗原特異的T細胞のクロノタイプ解析を利用した新規マイナー組織適合抗原の同定」研究成果報告書　課題番号14657243（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-14657243/)を加工して作