Extraktion pharmazeutisch einsetzbarer Plasmid-DNA und Integration in einen skalierbaren Aufarbeitungsprozess

Streitner N. Extraktion pharmazeutisch einsetzbarer Plasmid-DNA und Integration in einen skalierbaren Aufarbeitungsprozess. Bielefeld (Germany): Bielefeld University; 2008.Die fortschreitende Entwicklung in der Gentherapie führt zu einem immer höheren Bedarf an therapeutisch einsetzbarer Plasmid DNA (pDNA). Zunächst war das Hauptziel der Gentherapie die Behandlung monogenetischer Erkrankungen und Infektionskrankheiten, bis Herz-Kreislauf-Erkrankungen und vor allem Krebs in den Fokus der Forschung rückten. Plasmid-DNA ist als nicht-viraler Vektor für den Transfer therapeutischer Gene geeignet und ist vor allem auch auf dem Gebiet der genetischen Impfung von Interesse. Gegenüber herkömmlichen Vakzinen bietet Plasmid-DNA den Vorteil, dass der Erreger nicht direkt in den Körper gelangt, sondern lediglich die genetische Information eines Antigens, deren Expression im Körper eine zelluläre oder humorale Immunantwort auslöst. Plasmide kommen in Bakterienzellen und anderen Mikroorganismen vor. Die Replikation findet unabhängig von der Wirts-DNA statt. Die kodierten Gene bieten beispielsweise durch Antibiotikaresistenz einen Selektionsvorteil für den Wirtsorganismus. Modifizierte Plasmide sind als Klonierungsvektoren für die molekulare Biologie und Biotechnologie von Bedeutung. Um Plasmid-DNA in ausreichenden Mengen herstellen zu können, sind effiziente und gut skalierbare Prozesse notwendig. Für den Einsatz im gentherapeutischen Bereich werden hohe Qualitätsanforderungen gestellt. Diesbezüglich müssen die Anforderungen regulatorischer Behörden (Food and Drug Administration, FDA/ European Medicines Agency, EMEA) eingehalten werden. Verfahren zur Herstellung von Plasmid-DNA bestehen aus der Kultivierung der plasmidreplizierenden Bakterien, einem Zellaufschluss zur Freisetzung der Plasmide und im Anschluss daran geeigneten Aufarbeitungsprozessen. Die bioverfahrenstechnische Herausforderung besteht in der Abtrennung der superspiralisierten Plasmid-DNA von strukturell ähnlichen Verunreinigungen wie RNA, chromosomaler DNA (chrDNA) und Lipopolysacchariden (LPS). In der Regel werden zur Aufreinigung von Plasmid-DNA chromatographische Verfahren eingesetzt. Die meisten dieser Methoden sind zeitaufwändig, mit hohen Produktverlusten verbunden oder es bestehen Schwierigkeiten in der Maßstabsvergrößerung. Eine Alternative stellen Extraktionsprozesse dar, da diese gut skalierbar sind und lediglich einfache und kostengünstige Chemikalien und Geräte benötigt werden. Es können sowohl wässrige als auch inversmizellare Zweiphasensystemen zur Aufarbeitung von Plasmid-DNA eingesetzt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Verteilung von Nukleinsäuren in einem inversmizellaren Zweiphasensystem untersucht. Es wurde der Einfluss verschiedener Salze und Salzkonzentrationen sowie die Auswirkung unterschiedlicher Alkohole auf das Extraktionssystem betrachtet. Im Fokus der Untersuchungen stand die Trennleistung des Systems. Darüber hinaus wurde die Kapazität und die Möglichkeit zur Trennung verschiedener Plasmidformen geprüft. Die Ergebnisse konnten erfolgreich eingesetzt werden, um RNA, Proteine, chromosomale DNA und Endotoxine während der Extraktion der Plasmid-DNA aus einem konditionierten bakteriellen Klarlysat abzureichern

Isolation of Plasmid-DNA by inverse micelles two phase system - Optimization of the reverse extraction

Streitner N, Voß C, Flaschel E. Isolation of Plasmid-DNA by inverse micelles two phase system - Optimization of the reverse extraction. CHEMIE INGENIEUR TECHNIK. 2008;80(6):831-837

Reverse micellar extraction systems for the purification of pharmaceutical grade plasmid DNA

Streitner N, Voß C, Flaschel E. Reverse micellar extraction systems for the purification of pharmaceutical grade plasmid DNA. JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY. 2007;131(2):188-196.Plasmid DNA as an active pharmaceutical ingredient (API) is gaining more and more importance. For the production of multigram quantities of this substance robust and scalable processes comprising several purification steps have to be designed. One main challenge is the initial separation of plasmid DNA and RNA in such a purification scheme. In this study we investigated the distribution of plasmid DNA and RNA in reverse micellar two-phase systems which is considered to be the basis for the development of an extractive purification step that can easily be integrated into common processes. For this purpose the distribution of the 4.6 kb plasmid pUT649 and Escherichia coli RNA in systems comprising isooctane, ethylhexanol, and the surfactant methyltrioctylammoniumchloride (TOMAC) under the influence of different salts was studied. Anion concentrations at which the partitioning behaviour for nucleic acids inverted (inversion point) were identified. Systems capable of separating RNA from plasmid DNA were further analysed and applied to extract RNA from plasmid DNA out of a preconditioned cleared lysate. The capability of reverse micellar systems for plasmid form separation was also shown by capillary and agarose gel electrophoresis. (C) 2007 Elsevier B.V. All rights reserved

Generation of chromosomal DNA during alkaline lysis and removal by reverse micellar extraction

Tschapalda K, Streitner N, Voß C, Flaschel E. Generation of chromosomal DNA during alkaline lysis and removal by reverse micellar extraction. APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY. 2009;84(1):199-204.The separation of structurally related impurities from pharmaceutical plasmid DNA by highly scalable purification techniques is a challenge for biochemical engineering. Next to RNA, proteins, and lipopolysaccharides, the chromosomal DNA of the plasmid replicating host has to be removed. Here, we describe the application of reverse micellar extraction for the separation of chromosomal from plasmid DNA. By applying different procedures for alkaline lysis, bacterial lysates with different amounts of chromosomal DNA were generated. A reverse micellar extraction step enabled us to deplete the concentration of this impurity below the required level of 50 mg g(-1) of plasmid DNA with almost complete plasmid recovery