PREOPERATIVE PREPARATION OF LIMBAL CELL TRANSPLANTS FOR THE TREATMENT OF OPTIC NEUROPATHY (EXPERIMENTAL STUDY)

Purpose. To study experimentally in vitro secretion of the nerve growth factor (NGF) and the brain-derived neurotrophic factor (BDNF) using intact and induced multi-potent mesenchymal limbal stem cells (MSCs) in three-dimensional culture (3D).Material and methods. MSCs were obtained by culturing of limbal fragments, isolated from the cadaveric human donor eyes, according to the medical technology of the S. Fyodorov Eye Microsurgery Federal State Institution. The phenotype of obtained cell culture was studied by the flow cytometry method.Stimulation of secretion of neurotrophic factors was performed via a two-step technique using non-specific activation factors: EGF, hbFGF, N2 additive, dibutyryl cAMP, NRG1-beta 1, PDGF, 3-isobutyl-1- methylxanthine. The 3D-cell spheroids were generated using agarose plates (3D Petri dishes, Microtissue, USA) for three comparative groups where: Group I – control, Group II – with the induction of spheroids at 1 day of cultivation; Group III – with induction of spheroids at 7 days of cultivation. The concentration of NGF and BDNF in the culture medium was studied using the enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).Results. The induction of the 3D spheroids of limbal MSCs, that carried out on the 1st and 7th days of incubation, contributes to a significant increase in the production of NGF and BDNF, but subsequently a pronounced reduction in the secretion of these factors is observed. The conducting of an induction leads to a change in the morphology of spheroids: loss of compactness, the emergence of «fringed» (debris). Such changes indicate a non-viability of the obtained 3D-cell spheroids.Conclusion. The cellular spheroids, created from 2D-culture of intact limbal MSCs by the three-dimensional culture method, are capable in sufficient therapeutic concentrations spontaneously to synthesize NGF and BDNF, have the most optimal design for transplantation in extrabulbar and intraocular tissue niches of the eyeball, are a potential source of prolonged secretion of neural basis function in cell treatment of optic neuropathy

Клеточная нейропротекция как современный подход к лечению оптических нейропатий

Aim. To develop technology to create 3D-spheroid multipotent mesenchymal stem cells (MMSC) of limbal cadaveric human eyes, capable of safe and long-term secretion of nerve growth factor (NGF) and brain-derived neurotrophic factor (BDNF).Materials and methods. MMSC were obtained by cultivation of limbal fragments, released from cadaveric donor human eye. Cultivation was carried out in DMEM/F12 medium, supplemented with L-glutamine, penicillin, streptomycin, amphotericin B, HEPES, insulin, dexamethasone and 10 vol.% FBS under standard conditions (5% СО2, 37 °C), medium change was performed every 3 days. To determine the phenotype of the received cell culture the method of immunophenotyping by marker proteins to MMSC (CD73, CD105, CD19, CD90, CD133) was used. Stimulation of neurotrophic factor secretion was performed via a twostep procedure. 3D-cell spheroids were created with the help of agarous plates for three groups of comparison, where group I was control group, spheroids of intact 2D-culture MMSK; group II – spheroids of previously induced 2D-culture MMSC; group III – spheroids of 2D-MMSC induced on the 1st day of cultivation. Cell cultures supernatants were selected in different periods for NGF and BDNF follow-up study by ELISA procedure.Results. Induction of 3D-spheroids of limbal MMSC promotes short-term increase of the level of BDNF and NGF, but further, the secretion of these factors significantly decreases. Induction leads to a change in the morphology of spheroids: loss of compactness and emergence of «fringed» (debris). Such changes indicate of frailty of received constructions. Spheroids from previously induced MMSC are capable of stable NTF secretion, but the level of secretion is much less as compared to the control group.Conclusion. 3D-cell culture of intact 2Dculture of limbal MMSC can be considered as cellular medication for a safe and long-term neuroprotection in optic neuropathy treatment.Цель. Разработать технологию создания 3D-сфероидов мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток лимба кадаверных глаз человека, способных к длительной и достаточной секреции фактора роста нервов и нейротрофического фактора головного мозга.Материал и методы. Из кадаверных глаз человека (n = 8) выделялась зона лимба, содержащая наибольшее количество ММСК. Культивирование проводилось в среде: DMEM/F12 (1:1), L-глутамин, пенициллин, стрептомицин, амфотерицин В, HEPES, инсулин, дексаметазон, 10 об. % FBS при стандартных условиях (5% СО2, 37 °C), смена среды проводилась каждые 3 дня. Фенотип полученной культуры клеток изучали методом иммунофенотипирования с использованием набора маркеров к мембранным белкам (CD73, CD105, CD19, CD90, CD133). Стимуляцию секреции нейротрофических факторов проводили по двухэтапной методике с использованием неспецифических факторов активации. 3D-клеточные сфероиды создавали с использованием агарозных планшетов (3D Petri Dishes, Microtissue, США) для трех групп сравнения: I группа – контрольная, сфероиды из интактной 2D-культуры ММСК; II группа – сфероиды из индуцированной 2D-культуры ММСК; III группа – сфероиды из интактной 2D-культуры ММСК, индуцированные на 1-е сутки культивирования. Образцы консервационной среды замораживались при t –80 °С для дальнейшего исследования на содержание в них ФРН и БДНФ методом иммуноферментного анализа.Результаты. Индукция 3D-сфероидов ММСК лимба способствует значительному увеличению продукции ФРН и НФГМ, однако в дальнейшем наблюдается выраженное снижение секреции этих факторов. Проведение индукции приводит к изменению морфологии сфероидов: потере компактности, появлению «бахромчатости» (дебриса). Подобные изменения свидетельствуют о нежизнеспособности полученных конструкций. Сфероиды, созданные из индуцированных ММСК, способны к стабильной секреции НТФ, однако уровень секреции факторов значительно меньше по сравнению с группой контроля.Заключение. 3D-клеточные сфероиды, созданные из 2D-культуры интактных ММСК лимба, могут рассматриваться в качестве клеточного препарата для безопасной и длительной нейропротекции в лечении оптических нейропатий