C型肝炎ウイルスの複製酵素と複製を標的とした阻害剤のデザイン開発

HCVの持続感染の遮断が肝がん発症のリスクを低下させると期待される。HCVは宿主とは異なるRNA複製過程があり、RNA依存RNA合成酵素(RdRP)であるNS5BはHCV複製遮断の有力な標的である。HCV複製の阻止を目標に、HCVNA5Bの構造と機能の検討を行った。我々は、1)集約型と点置換アラニン変異を系統的に導入し、NS5BのRdRP活性に必須である5アミノ酸残基を新たに特定した。RdRP活性には鋳型結合能は要求せず、鋳型/primer結合能を要求した(Hepatol., 2001)。2)NS5Bがhomomericにオリゴマー化することを見い出し、オリゴマーに必須な2残基を特定した。各種置換変異による解析から、この2残基の交換が可能である結果を得た(J.Biol Chem., 2002)。3)NS5BとNS5Aの特異的結合を見い出し、集約型アラニン置換変異NS5Bによる解析から4配列がNS5A結合に必要な領域と限定し、NS5AがNS5BのRdRP活性を修飾することを見い出した(J.Biol.Chem., 2002)。4)ヌクレオリンと全長型NS5Bの膜構造での共局在を見い出した。相互作用はヌクレオリンのC端側の領域と、NS5Bでは2つの領域に限定された。ヌクレオリン結合欠損のNS5Bの変異で、全長NS5Bとヌクレオリンの共局在は観察されなかった(J.Biol.Chem., in press, 2003)。HCV複製の阻害剤開発の新たなデザインとして、NS5Bのオリゴマー化、NS5Aとの相互作用、及びヌクレオリン結合領域が標的となる可能性を示唆した。今後HCVレプリコン系を用いたHCV複製の効果の比較が必要である。As inhibition of HCV replication is expected to reduce or even block incidence of HCV-associated hepatocellular carcinoma, HCV NS5B, aRNA-dependent RNA polymerase, might be a strong target for drug designs to inhibit HCV replication. The main results are followings. 1) 5 residues of NS5B were newly identified to be critical for RNA-dependent RNA synthesis (RdRP) activity. 2)Two residues among them located far from the RdRP catalytic center were specified to be indispensable ones for oligomerization of NS5B. The oligomerization of NS5B was found to be prerequisite to RdRP activity of NS5B by demonstrating that the two residues are residue-specific and exchangeable for oligomerization and RdRP activities. 3)Specific interaction between NS5A and NS5B was characterized, and we found that NS5A can modulate RdRP activity through the direct interaction in vitro. 4) Nucleolin, was found to bind directly to NS5B and affected subcellular localization of NS5B when the C-terminal membrane-attachment domain was truncated. These interaction surfaces of NS5B would be putative targets for drug designs to inhibit HCV replication.研究課題/領域番号:12558084, 研究期間(年度):2000-2002出典：「C型肝炎ウイルスの複製酵素と複製を標的とした阻害剤のデザイン開発」研究成果報告書　課題番号12558084 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）)　　　本文データは著者版報告書より作

転写開始複合体形成におけるRNAポリメラーゼサブユニットRPB5の役割と転写制御

我々は、B型肝炎ウイルスX蛋白に結合する宿主蛋白の探索から、RNAPI,II,IIIに共通するサブユニットであるRPB5をX結合蛋白として単離した。本研究は、両者の相互作用による転写開始機能の修飾を分子機構として解明するために、RPB5の機能標的を探索し、X蛋白の役割を検討し、RPB5の構造と機能の解析を行った。(1)RPB5は、X蛋白と相互作用をすると共に、転写基本因子TFIIBと特異的に結合することがin vitro 及びin vivoで確認された。TFIIBはRPB5と共にHBV X蛋白と特異的に相互作用し、3者の複合体形成がin vitro及びin vivoで確認した。(2)X蛋白のトランス活性化ドメインの置換変異の解析から、トランス活性化ドメイン内にRPB5及びTFII結合の区別される領域の存在が示され、X蛋白のトランス活性化にはRPB5とTFIIBとの結合が何れも必要であることが示された。3者の複合体形成と3者間結合のXトランス活性化能への効果は、X蛋白は転写開始複合体形成の段階でRNAPとTFIIBの結合を安定化する可能性が示唆された。(3)人工的な系であるGa14x5CATを用いた検討の結果、HBxはactivated Transcription系でco-factor機能を保持していた。X蛋白が機能する段階の検討が今後に残された。(4)RPB5がX蛋白と相互作用し転写の効率化をもたらす結果は、X蛋白がRPB5と内在性の宿主蛋白との相互作用を排除する可能性がある。この可能性を検討するために、RPB5結合蛋白のcDNA単離をfar-Westem法を用いて行い、I種のcDNA(RPB5-mediating-protein : RMP)を単離した。全長cDNAの単離を進めた結果、RMPは新規遺伝子であった(投稿準備中)。予備的結果は、RMPがX蛋白によるトランス活性化に拮抗した。この結果はRMPが抗X遺伝子として機能することを示唆した。RMPが新規のがん抑制遺伝子である可能性もあり、今後の系統的な解析が必要となった。Our previous finding that HBx directly interacts with RPB5, a common subunit of RNA polymerases, implies that HBx modulates the function of RNA polymerase directly. This project addressed the molecular mechanism of transcriptional modulation of RPB5 by HBx. 1.We found that both HBx and RPB5 specifically bound to TFIIB in vitro and in vivo. We could detect the ternary complex consisting of RPB5, HBx, and TFIIB in vivo and in vitro. 2.Some HBx substitution mutants, which were severely impaired in transacting activity, exhibited reduced binding affinity with either TFIIB or RPB5 in a mutually exclusive manner, suggesting that HBx transactivation requires the interactions of both RPB5 and TFIIB.The results indicate that HBx is a novel virus modulator that facilitates transcriptional initiation by stabilizing the association between RNA polymerase and TFIIB through communication with RPB5 and TFIIB.3.We addressed whether HBx acts as a transcriptional activator when it is recruited to a distal cis-element, and whether HBx positively affects in vitro transcription. The results indicated that HBx can not act as a transcriptional transactivator but can act as a cofactor involving in transcription through protein-protein interaction. 4.To understand the function of RPB5, we tried to isolate RPB5-binding protein by direct cDNA cloning using far-Western blotting. We successed to isolate a cCNA redundantly which was found unreported and unique. The gene was designated as RPB5 mediating protein (RMP). Preliminarily experiments showed that RMP may interfer transactivation of HBx in mammalian cells. The results suggest that RMP may antagonize HBx. Further characterization of RMP is on going.研究課題/領域番号:07458178, 研究期間(年度):1995-199

C型肝炎ウイルス(HCV)NS5BのRNA合成活性と炎症応答の修飾

HCVの持続感染の遮断が肝がん発症のリスクを低下させると期待される。HCVは宿主とは異なるRNA複製過程があり、RNA複製酵素であるNS5BはHCV複製遮断の有力な標的である。HCV複製の阻止を目標に、HCV複製酵素NS5Bの構造と機能の検討と、NS5Bの宿主の炎症応答経路への影響の検討を行った。我々は、集約的な及び1残基のアラニン置換変異を系統的に導入し、NS5Bの諸機能を解析した。その結果1)NS5BのRNA依存RNA合成(RdRP)活性に必須である5アミノ酸残基を新たに特定した(Hepatology,in press)。2)NS5BのRdRP活性には、鋳型結合能は要求せず、鋳型/primer結合能を要求した。Y276が鋳型/primerに必須なアミノ酸残基として特定された。3)活性中心より離れたRdRP活性に必須2残基が、NS5Bのhomomericな相互作用に関わることを見い出し、各種の置換変異を用いてhomomericな作用がRdRP活性に必須で、この2残基は相互作用に直接関わる残基の可能性が強く示唆された。4)NS5Bの過剰発現系で炎症関連シス配列AP-1、NFkBの活性化を認めた。しかしアラニンスキャンでNS5Bの特定配列との相関が認められず、発現量によってNS5Bの転写活性化効果は変動した。NS5Bによる炎症関連遺伝子の修飾の可能性はあるが、感染時にHCVの他の蛋白が同時発現する条件で、NS5Bの微量発現が今回観察された効果が得られるか否かは今後の検討に残された。Eradication of HCV has been expected to reduce or prevent incidence of HCC.HCV NS5B, RNA-dependent RNA polymerase(RdRP), is a target to inhibit HCV replication. We constructed a series of clustered and point alanine substitution mutations of NS5B and examined the effects of the mutations on functions of NS5B.The results are followings. 1)5 amino acid residues were newly identified to be indispensable for RdRP activity(Hepatology, in press). All are outside of the motifs conserved among RdRPs and reverse transcriptases. The result may provide desigins for specific inhibitors for HCV RdRP.2)RdRP activity of NS5B requires not template binding but template/primer. All mutants negative in the template binding are positive in RdRP activity except Y276A which is both negative in template/primer binding and RdRP activity. 3)The two residues apart from the catalytic center of RdRP activity are important for oligomerization of NS5B which we could find to be essential for RdRP activity. 4)Overexpression of NS5B activated AP-1 and NF-kB critical for acute inflammatory response, but a NS5B sequence could not be specified to be responsible for the activation which is influenced by expression level of NS5B.NS5B may modulate inflammatory responses but it remains addressed whether our observation has biological relevance in chronic HCV infection where a low amount of NS5B with coordinated expression of the other NS proteins is expected.研究課題/領域番号:11694257, 研究期間(年度):1999-2000出典：「C型肝炎ウイルス(HCV)NS5BのRNA合成活性と炎症応答の修飾」研究成果報告書　課題番号11694257(KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）)　　　本文データは著者版報告書より作

テロメラーゼの細胞内局在と活性制御

テロメラーゼは抗がん剤研究の有力な標的である。本年度、FLAG標識hTERT発現HeLa細胞のヒトテロメラーゼ複合体とhTERTと相互作用するヌクレオリンの生物的機能の解析(村上)、hTERT発現による不死化ヒト初代細胞系の解析(本多)、更に細胞の増殖・分化などに重要な役割を担う受容体型チロシンキナーゼの解析(善岡)を行った。得られた主な結果は、1)HeLa細胞にFLAG-hTERTを導入して得られた活性型組み換え型テロメラーゼは、昆虫細胞系2成分発現ヒトテロメラーゼ複合体と類似して、分子篩法で2種類の複合体(IとII)に分画された。Hsp90を含まず、Hsp90阻害剤に耐性の複合体Iと、Hsp90を含む後者の複合体IIは、Hsp90阻害剤に感受性を示し内在性及びFLAG標識hTERTは共に不安定であった。また内因性hTERTとFLAG-hTERTの大半は複合体Iに分布した。ヌクレオリンが複合体Iに含まれ、複合体IIには殆ど含まれない。これらの結果は、細胞内で異なる2種類の活性型テロメラーゼ複合体が存在し、テロメラーゼの異なる局在或いは活性型テロメラーゼの異なる機能を示唆した。2)hTERT発現レトロウイルスベクターをヒト正常線維芽(BJ)細胞に感染させ、hTERT発現細胞が不死化した細胞株を樹立した。ジーンチップ解析では、hTERT導入不死化BJ細胞ではBJ細胞に比較し、細胞増殖、細胞周期に関与する因子の発現亢進が認められた。3)hTERTと特異的に相互作用するヌクレオリンは、C型肝炎ウイルス(HCV)複製に必須であることが、ヌクレオリン結合性を消失したHCV NS5B変異を持つHCVサブレプリコン系ではHCV複製が全く起きないことと、RNAi法でヌクレオリン発現が低下した細胞では、HCV複製が大きく低下する結果により示された。Since telomerase activity is barely detectable in primary cells but clearly detected in cancerous cells, telomerase has been considered to be a strong candidate of the targets to cancer treatment In the fiscal year, we concentrated in several experiments including purification and characterization of recombinant human telomerase complex, and biological function of the specific interaction of nucleolin and hTERT recovered from a HeLa cell line stably expressing FLAG-hTERT (Murakami), analyses of human primary cells immortalized by hTERT (Honda), and the tyrosine kinases of receptor type which play critical odes in cell proliferation and differentiation (Yoshioka). The followings are the main conclusions of the experiments.1) The partially purified active telomerase complexes comprise two different complexities, complex I (around 680 kDa), and complex II (around 400 kDa), that are quite alike to those that can be recovered firm the insect cells co-expressing FLAG-hTERT and hTERC. The com plex I does not contain Hsp90 and is resistant to Hsp90 inhibitors, whereas complex II contains Hsp90 and is sensitive to Hsp90 inhibitors. Human TEAT in the complex II is rather unstable during incubation in vim and in ring. Such unstable property was not observed with the complex I. Since MG132, a specific proteasome inhibitor, but not MG133, a negative control, stabilized hTERT in the complex Z strongly suggesting that hTERT in the complex If is under degradation pathway under the control of proteasome. The two different complexities of human telomerase seem to imply two different entities of active telomerase in different subcellular localization or its different functions. 2) We have established a cell line of the human primary fibroblasts(BJ cells) stably expressing hTERT, and we compared expression profiles of RI cells and the KJ cells immortalized by MERE Some genes involving in cell cycle progression and cell proliferation were evidently expressed higher in the immortalized 131-hTERT than these in in the primary cells. 3) Nucleolin, one of the specific interacting partners of hTERT can bind to Hepatitis C Virus (HCV) NS5B, RNA-dependent RNA replication of HCV. We evaluated the role of the specific interaction of nucleolin and NS5B in HCV replication. The HCV subreplicon system has been applied for the address We found that the HCV subreplicons harboring alanine substitution mutations or mutation at the residue(s) either one of two critical sequences within NS5B both of which are necessary for the nucleolin-binding could not replicate at all in a transient HCV replication system in HepG2 ml/s., although the wild replicon could support efficient HCV. By introducing transiently RNAi of nucleolin, that down regulated expression of nucleolin by half to one third, reduced HCV evidently reduced HCV replication using the HCV subreplicon system. Taken together, the specific interaction of nucleolin and NS5B is critical for HCV replication.研究課題/領域番号:17390091, 研究期間(年度):2005-2007出典：「テロメラーゼの細胞内局在と活性制御」研究成果報告書　課題番号17390091 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）)　　　本文データは著者版報告書より作

B型肝炎ウイルスX蛋白の転写修飾機能と細胞形質転換能促進

金沢大学がん進展制御研究所HBV X蛋白(HBx)はRNA polymerase subunit 5 (RPB5)及びTFIIBと相互作用し、転写のcoactivatorとして機能することをin vivo及びin vitro転写系で報告した。我々は、多機能制御蛋白HBxについて、集約型アラニン置換変異(Cm)ライブラリー等を用いて,転写修飾の分子機構、HBVウイルス増殖への役割、ヒト初代細胞への形質転換能の検討を行い、以下の結果を得た。1)HBxのCm変異ライブラリーの解析により、RPB5結合に必須な配列をcoactivationドメイン内に限定した。この配列は、coactivationに必要な配列の一部の配列であった。HBxの核内標的であるRPB5のCm及び点置換変異(Pm)ライブラリーを用いて、HBxの結合に必須な6残基を特定し、その内4残基はTFIIFサブユニットRAP30との結合にも必須であった。これら4残基の変異酵母RPB5は、増殖温度感受性を示した(J. Biochem(Tokyo),2005)。2)RPB5のDNA結合能を、ゲルシフト法で確認した。結合に必須な残基をRPB5のCm及び点置換変異(Pm)ライブラリーを用いて解析した結果、溶媒に表出したT111が必須で、S113が重要な役割を果たしている結果を得て、RPB5のDNA結合能がRPB5の転写修飾の標的である可能性が提出された(投稿中)。3)ヒト初代細胞の不死化と、ヒト不死化細胞の形質転換にHBxがどのような効果を持つかを解析した。野生型及び各種HBx発現レトルウイルスをヒト初代細胞及びヒト不死化細胞に導入し、不死化率と形質転換率を測定した。その結果、HBxは単独では、ヒト初代細胞の不死化にも、hTERT導入ヒト不死化細胞の形質転換にも影響を与えなかった。しかし、hTERT導入ヒト不死化細胞に活性化型RASの導入による老化誘導(Oncogene-induced senescence : OIS)は、HBxの導入によって克服された。RAS+HBx発現ヒト不死化細胞は、soft agarでコロニー形成能とヌードマウスで造腫瘍性を示した。HBxのOIS克服にはN端ドメインとcoactivationドメインが共に必要であり、coactivationドメイン単独では、不死化の克服は観察されたが、anchorage-independentな増殖と形質転換は観察されなかった(投稿中)。現在HBx Cmライブラリーを用いてOISに必要な配列の特定を行っている。研究課題/領域番号:17013035, 研究期間(年度):2005出典：「B型肝炎ウイルスX蛋白の転写修飾機能と細胞形質転換能促進」研究成果報告書　課題番号17013035（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-17013035/)を加工して作

B型肝炎ウイルスX蛋白の機能

金沢大学がん研究所HBV X蛋白(HBx)はRNA polymerase subunit 5(RPB5)及びTFIIBと相互作用し、転写のcoactivatorとして機能することをin vivo及びin vitro転写系で報告した。HBxの転写修飾の分子機構の解明とHBxのHBVウイルス増殖への影響と宿主細胞への影響を評価を検討した。1.RPB5の中央部と基本転写因子TFIIFサブユニットRAP30の結合が、Pol IIとTFIIFの会合に必須で、RAP30の中央部の2残基がこの結合に関与していた。置換、変異を用いHBxの結合に必須な6残基と、TFIIFサブユニットRAP30との結合に必須な6残基を特定し、その内4残基が共通であった(投稿中)。RPB5のDNA結合能にもこの4残基が必須または重要であるから、RPB5のDNA結合能がRPB5の転写修飾の標的である可能性が示された。2.HBxに拮抗するRMP/URIの相互作用パートナーとしてcorepressorであるDMAP1を同定した。また、RMP/URIの細胞内局在を検討した結果、RMP/URIは細胞質と核内とで異なった機能を持つ制御蛋白と考えられた。3.野生型及びHBVレプリコンに外来性HBxを共存させHBV複製を検討した。HBxのcoactivationドメイン内の2つの不連続な領域がHBV複製促進及びHBV DNA複製の鋳型となるpregenomic (pg) RNAの合成に必要であった。HBxのcoactivation能がpgRNA合成の促進に必要で、この効果によりHBV DNA複製が元進されると推定された。4.HBxのヒト初代細胞の不死化と、ヒト不死化細胞の形質転換へ及ぼす効果を、野生型及び各種HBx発現レトルウイルスを用いて解析した。HBx及びHBxのcoactivationドメインは、不死化効率には影響を与えないが、形質転換率を促進する結果を得た。For better understanding molecular mechanism of transcriptional modulation by HBV X protein (HBx), we studied structure and function of RNA polymerase subunit 5 (RPB5) as a nuclear target of HBx, and contribution of HBx on immortalization and/or transformation process of human cells. In addition, subcellular localization and nuclear function of RMP which is a functional antagonist of HBx. The followings are main results of the project in this fiscal year.1) By analyzing clustered alanine substitution mutant (Cm) and point mutant (Pm) libraries of the middle part of RPB5, we pinpointed 6 resideus critical for HBx-binding and 6 residues for TFIIF subunit RAP30-binding.Among them, 4 residues・F76, 1104, T111 and S113, are critical both for the bindings. The former two residues are not solvent exposed and probably contributing to the structural integrity. T111 and S113 are exposed and is in near position to DNA in light of the Pol II crystal models. The 4 residues are also critical or important for DNA-binding ability of RPB5 (in preparation). Taken together, DNA-binding ability of RPB5 may be the target of HBx and RAP30.2) Using the Cm library of HBx, we addressed the critical region(s) of HBx for augmentation ability on HBV replication in a HBV replicon system. which is defective in X-ORF. Two discontinuous regions in the coactivation domain of HBx are indispensable for the augmentation effect on HBV replication. In the same experiment, the same regions were required not only for increase in HBV DNA but also for increase in pregenomic (pg) RNA. The same regions were also critical for the coactivation function of HBx, suggesting that HBx coactivates pgRNA synthesis that resulted in increase in HBV DNA synthesis.3) Recently it was found that RMP/URI, a functional antagonist of HBx, is localized with RPB5 in cytoplasm. Subcellular localization of RMP/URI can be modulated in the presence of DMAP1 and nuclear RMP/URI acts as a corepressor. From these results, RMP/URI is a regulatory protein in cytoplasm as well as nucleus.4) We addressed whether HBx acts positively in immortalization and/or transformation process of human cells. In our preliminary results, immortalization of human primary cells is barely affected by HBx, but transformation frequency of immortalized human cells seems to be augmented by HBx in the presence of activated oncogenes. This facilitating role of HBx requires the coactivation domain of HBx.研究課題/領域番号:13555218, 研究期間(年度):2001-2010出典：研究課題「B型肝炎ウイルスX蛋白の機能」課題番号12213050（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-12213050/122130502004kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/）を加工して作