Espectroscopia infrarroja en el estudio de proteínas y membranas lipídicas

La comprensión del funcionamiento de la célula viva es una de las construcciones intelectuales más destacadas que hemos elaborado. Desde el punto de vista termodinámico la concepto es relativamente simple: la célula es un sistema abierto que genera orden local a partir de la disipación, o aumento de la entropía del universo. La descripción de los procesos individuales que sustentan ese intercambio de energía y generación de orden es un poco más compleja, involucra la descripción de múltiples vías metabólicas simultáneas, y la identificación de sustratos, catalizadores y productos en una complicada organización temporal y espacial. Esta descripción se sustenta en la capacidad analítica de identificar compuestos químicos relativamente simples y macromoléculas complejas, sus conformaciones y la relación entre estas conformaciones y sus actividades químicas. Dentro de las herramientas analíticas, la espectroscopia tiene un papel central. También aquí el fundamento es simple: la comparación entre la radiación electromagnética incidente y la emitida o transmitida por la muestra brinda información sobre las moléculas que interactuaron con la radiación.Facultad de Ciencias Exacta

Relevance of the protein macrodipole in the membrane-binding process. Interactions of fatty-acid binding proteins with cationic lipid membranes

The fatty acid-binding proteins L-BABP and Rep1-NCXSQ bind to anionic lipid membranes by electrostatic interactions. According to Molecular Dynamics (MD) simulations, the interaction of the protein macrodipole with the membrane electric field is a driving force for protein binding and orientation in the interface. To further explore this hypothesis, we studied the interactions of these proteins with cationic lipid membranes. As in the case of anionic lipid membranes, we found that both proteins, carrying a negative as well as a positive net charge, were bound to the positively charged membrane. Their major axis, those connecting the bottom of the β-barrel with the α-helix portal domain, were rotated about 180 degrees as compared with their orientations in the anionic lipid membranes. Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy of the proteins showed that the positively charged membranes were also able to induce conformational changes with a reduction of the β-strand proportion and an increase in α-helix secondary structure. Fatty acid-binding proteins (FABPs) are involved in several cell processes, such as maintaining lipid homeostasis in cells. They transport hydrophobic molecules in aqueous medium and deliver them into lipid membranes. Therefore, the interfacial orientation and conformation, both shown herein to be electrostatically determined, have a strong correlation with the specific mechanism by which each particular FABP exerts its biological function.Fil: Galassi, Vanesa Viviana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; ArgentinaFil: Villarreal, Marcos Ariel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Instituto de Investigaciones en Físico-química de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Instituto de Investigaciones en Físico-química de Córdoba; ArgentinaFil: Montich, Guillermo Gabriel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentin

Interaction of the antibiotic peptide nisin with anionic membranes in different phase-states: A vibrational study

Interactions between the antibiotic peptide nisin and multilamellar vesicles of phosphoglycerol lipids in different phase-states were studied using vibrational spectroscopy. The infrared amide I′ band of nisin, both in solution and in the membrane-bound state, was analyzed in the temperature range comprised between 20 and 60 °C in order to study its conformational behavior. Nisin presented mainly unordered and β-turns conformations. Their relative populations varied according to the environment and as the temperature increased: β turns were more favored in the membrane-bound state than in solution, but at higher temperatures the disordered conformation was dominant in both states. Spectral changes of specific infrared bands belonging to the hydrocarbon and polar moieties of lipids were also analyzed to evaluate the perturbation of the lipid membrane order. Nisin interactions with the membrane polar region induced a high restriction to water incorporation, promoting a small increase in the temperature of the lipid phase transition. Raman spectra of nisin/phosphoglycerol systems at ambient temperature were also analyzed. They revealed that the peptide incorporation to a membrane in the fluid phase caused drastic structural modifications in the hydrophobic region of the bilayer. Although nisin may be able to disrupt the hydrophobic portion of the bilayer in the gel phase, the most of the peptide molecule remained at the membrane surface interacting with the polar headgroups. This work provides evidence of a differential effect of nisin on anionic membranes, depending on the phase-state of the lipid.Fil: Sosa Morales, Marcelo Clemente. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Instituto de Química del Noroeste. Universidad Nacional de Tucumán. Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia. Instituto de Química del Noroeste; ArgentinaFil: Juárez, Ana Carolina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Instituto de Química del Noroeste. Universidad Nacional de Tucumán. Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia. Instituto de Química del Noroeste; ArgentinaFil: Montich, Guillermo Gabriel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; ArgentinaFil: Alvarez, Rosa Maria Susana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Instituto de Química del Noroeste. Universidad Nacional de Tucumán. Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia. Instituto de Química del Noroeste; Argentin

Cytoplasmatic domain of Na,K-ATPase α-subunit is responsible for the aggregation of the enzyme in proteoliposomes

We studied the thermal dependence of amide I′ infrared absorption and fluorescence emission of Trp residues in the Na,K-ATPase of rabbit kidney. We studied the whole enzyme solubilized with detergent, the whole enzyme reconstituted in proteoliposomes and the protein fraction that remained in the lipid membrane after the trypsin digestion of the proteoliposomes. Cooperative unfolding and aggregation with increasing temperature were observed in the whole protein, whether solubilized or reconstituted, but not in the fraction remaining after trypsinization. The protein influenced the physical state of the lipid, decreasing the temperature of the gel to liquid-crystalline phase transition and the degree of cooperativity. This study provides new information for the understanding of the processes controlling the association mechanisms that are important for enzyme function in natural membranes. © 2009 Elsevier B.V. All rights reserved.Fil: Rigos, Carolina Fortes. Universidade de Sao Paulo; BrasilFil: de Lima Santos, Hérica. Universidade Federal de Sao Joao Del-rei; BrasilFil: Yoneda, Juliana Sakamoto. Universidade de Sao Paulo; BrasilFil: Montich, Guillermo Gabriel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; ArgentinaFil: Maggio, Bruno. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; ArgentinaFil: Ciancaglini, Pietro. Universidade de Sao Paulo; Brasi

Estudio vibracional de la interacción entre nisina y membranas de fosfatidilglicerol conteniendo el receptor lípido II

Motivación: Las membranas bacterianas son el blanco del péptido antibiótico nisina, debido a la presencia del receptor lípido II (LII), que se une con alta especificidad al péptido formando un complejo (LII-nisina), capaz de permeabilizar las bicapas mediante la formación de poros e inhibir la síntesis de la pared celular.(1) Estas membranas presentan un alto contenido de fosfolípidos cargados negativamente, como los fosfogliceroles (PG), que favorecen las interacciones electrostáticas con las cargas positivas presentes en los aminoácidos lisina e histidina del péptido. Nuestro interés está centrado en el estudio de las alteraciones estructurales que sufren las membranas modelo de PG por efecto del complejo LII-nisina, usando las espectroscopías vibracionales Raman e infarroja (IR). Resultados: Se realizó un análisis comparativo de los espectros mezcla PG/LII/nisina y PG/nisina con el espectro del lípido puro a fin de determinar los cambios producidos en bandas consideradas marcadores del empaquetamiento lipídico, del número de confórmeros gauche y del grado de hidratación de las cabezas polares de la membrana por acción del complejo LII-nisina. Se observó un aumento de la intensidad relativa de las bandas Raman de estiramiento C-H simétrico de los grupos CH3 terminales, sCH3 (~ 2930 cm-1), y de estiramiento C-C gauche de final de cadena, (C-C)f-G (~ 1081 cm-1), en el espectro PG/LII/nisina. También se encontró que la relación de intensidades a 1725 cm-1 y 1740 cm-1 (I1725/I1740) de la banda IR de estiramiento carbonilo (C=O) de las mezclas con nisina disminuye pero en menor grado cuando está presente el LII. Conclusiones: Las modificaciones producidas en las membranas por efecto del complejo o poro de LII-nisina se manifestaron en diferencias espectrales de vibraciones localizadas en la región interfacial y en lo profundo de la región hidrofóbica. Tales cambios mostraron que la formación de este complejo favorece tanto la expulsión de las moléculas de agua de la región polar como un mayor desorden y libertad rotacional de las cadenas alquílicas en la región central de la bicapa.Fil: Sosa Morales, Marcelo Clemente. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Instituto de Química del Noroeste. Universidad Nacional de Tucumán. Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia. Instituto de Química del Noroeste; Argentina. Universidad Nacional de Tucumán. Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia. Instituto de Química Física; ArgentinaFil: Juárez, Ana Carolina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Instituto de Química del Noroeste. Universidad Nacional de Tucumán. Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia. Instituto de Química del Noroeste; ArgentinaFil: Montich, Guillermo Gabriel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; ArgentinaFil: Alvarez, Rosa Maria Susana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Instituto de Química del Noroeste. Universidad Nacional de Tucumán. Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia. Instituto de Química del Noroeste; Argentina. Universidad Nacional de Tucumán. Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia. Instituto de Química Física; ArgentinaXX Congreso Argentino de Fisicoquímica y Química InorgánicaVilla Carlos PazArgentinaUniversidad Nacional de Río CuartoAsociación Argentina de Fisicoquímica y Química Inorgánic

A novel lipid binding protein is a factor required for MgATP stimulation of the squid nerve Na+/Ca2+ exchanger

Author Posting. © The Author(s), 2009. This is the author's version of the work. It is posted here by permission of Elsevier B.V. for personal use, not for redistribution. The definitive version was published in Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes 1788 (2009): 1255-1262, doi:10.1016/j.bbamem.2008.12.016.Here we identify a cytosolic factor essential for MgATP up-regulation of the squid nerve Na+/Ca2+ exchanger. Mass spectroscopy and Western blot analysis established that this factor is a member of the lipocalin super family of lipid binding proteins of 132 amino acids in length. We named it Regulatory protein of the squid nerve sodium calcium exchanger (ReP1-NCXSQ). ReP-1-NCXSQ was cloned, over expressed and purified. Far- UV circular dichroism and infrared spectra suggest a majority of β-strand in the secondary structure. Moreover, the predicted tertiary structure indicates ten β-sheets and two short α- helices characteristic of most lipid binding proteins. Functional experiments showed that in order to be active ReP1-NCXSQ must become phosphorylated in the presence of MgATP by a kinase that is Staurosporin insensitive. Even more, the phosphorylated ReP1-NCXSQ is able to stimulate the exchanger in the absence of ATP. In addition to the identification of a new member of the lipid binding protein family, this work shows, for the first time, the requirement of a lipid binding protein for metabolic regulation of an ion transporting system.The work was supported by Grants from the US National Science Foundation [MCB 0444598], Fondo Nacional para Investigaciones Científicas y Tecnológicas [PICT-05- 12397 and PICT-05-38073], Consejo Nacional de Investigfaciones Científicas y Técnicas [PIP 5118 and PIP 5593] Secretaría de Ciencia y Técnica Universidad Nacional de Córdoba, Argentina, Fondo Nacional para Ciencia y Técnica [S1-9900009046 and G- 2001000637] and Fundación Polar, Venezuela and The Rhode Island Idea Network of Biomedical Research Excellence (INBRE)

Electron spin resonance in membrane research: protein–lipid interactions from challenging beginnings to state of the art

Conventional electron paramagnetic resonance (EPR) spectra of lipids that are spin-labelled close to the terminal methyl end of the acyl chains are able to resolve the lipids directly contacting the protein from those in the fluid bilayer regions of the membrane. This allows determination of both the stoichiometry of lipid–protein interaction (i.e., number of lipid sites at the protein perimeter) and the selectivity of the protein for different lipid species (i.e., association constants relative to the background lipid). Spin-label EPR data are summarised for 20 or more different transmembrane peptides and proteins, and 7 distinct species of lipids. Lineshape simulations of the two-component conventional spin-label EPR spectra allow estimation of the rate at which protein-associated lipids exchange with those in the bulk fluid regions of the membrane. For lipids that do not display a selectivity for the protein, the intrinsic off-rates for exchange are in the region of 10 MHz: less than 10× slower than the rates of diffusive exchange in fluid lipid membranes. Lipids with an affinity for the protein, relative to the background lipid, have off-rates for leaving the protein that are correspondingly slower. Non-linear EPR, which depends on saturation of the spectrum at high radiation intensities, is optimally sensitive to dynamics on the timescale of spin-lattice relaxation, i.e., the microsecond regime. Both progressive saturation and saturation transfer EPR experiments provide definitive evidence that lipids at the protein interface are exchanging on this timescale. The sensitivity of non-linear EPR to low frequencies of spin exchange also allows the location of spin-labelled membrane protein residues relative to those of spin-labelled lipids, in double-labelling experiments