Investigating the expression of genes and proteins in Glioblastoma during hypoxia

Glioblastoma multiforme (GBM), grade IV Astrocytoma, is the most common and deadly form of brain cancer. Despite the low incidence rate (3.2 per 100.000 people), patient’s median survival is only 14 months. Notwithstanding all new diagnostic tools, GBM remains a therapeutic challenge, being extremely difficult to prevent recurrence. Therefore, it is essential to conduct research in order to understand the molecular pathways in the core of GBM aggressiveness and swift evolution. GBM is often characterized by hypoxic regions where oxygen levels are extremely low. As a natural consequence of tumour growth and expansion, some areas of the tumour become distanced from the blood vessels and consequently, from the oxygen supply. In such a critical environment, cells activate pro-survival and malignancy mechanisms such as the metabolic switch, invasion and angiogenesis. Hence we investigated the expression of genes featuring these survival mechanisms and identified a panel of hypoxia-driven-malignancy markers. To conduct this study, two GBM patient´s biopsy-derived cell lines (UP-029 and SEBTA-023) were used and cultured under hypoxic conditions for a selected set of time-points (time-course). To characterize the hypoxic response of these cells, hypoxia profiler microarrays were ran for normoxia, 6 and 48 hours of hypoxia (1% O2). Once identified the induced and repressed genes, these were analyzed and validated through qRT-PCR assays. Finally, western-blot analysis was performed to detect target proteins and correlate with the previously obtained gene expression data. Our study validated ANGPTL4, PIGF, VEGFA, GLUT1, PFKB4, PFKB3, BNIP3, DDIT4, NDRG1 and CAIX genes as relevant in GBM’s hypoxia-mediated response. We also pointed out MXI1, HNF4A genes as likely significant factors in GBM hypoxia. Furthermore, we hypothesize PFKB3 as an adaptive resistance marker in GBM and the repression of TFRC as required mechanism for GBM progression.O Glioblastoma multiforme (GBM) é a forma mais comum e letal de cancro no sistema nervoso central. Devido às suas caraterísticas altamente invasivas e malignas, o Glioblastoma foi considerado pela World Health Organization (WHO) como um Astrocitoma grau IV. Contrariamente a outros tipos de cancro de igual grau, a capacidade de invasão do GBM é limitada ao tecido cerebral. Apesar dos avanços nas tecnologias de diagnóstico e dos constantes progressos na investigação do cancro, o tratamento do GBM é meramente paliativo. A seletividade farmacológica da barreira hemato-encefálica, a elevada heterogeneidade tumoral e influência destrutiva do tumor no tecido nervoso, refletemse na ineficiência das terapias aplicadas. Clinicamente, o GBM manifesta-se através de pressão intracranial, cefaleias e/ou défices neurológicos tais como, alterações visuais, alterações da fala, dificuldades cognitivas e até modificações na personalidade. Embora, menos frequentes, convulsões também se encontram descritas como um dos sintomas. A taxa de incidência deste tipo de carcinoma é de facto baixa, sendo que em 100000 apenas 3.2 pessoas são afetadas. Não obstante, a média de sobrevida destes pacientes é somente 14 meses. Conduzir investigações no sentido de entender os mecanismos moleculares que se encontrar subjacentes à expansão e agressividade do GBM torna-se, portanto, essencial. Uma das características mais proeminentes do GBM são as regiões hipóxicas, onde os níveis de oxigénio são extremamente baixos. Esta é uma consequência natural, derivada da expansão tumoral e do incremento da distância de difusão de oxigénio. Estabelecido um microambiente como este, crítico para a sobrevivência celular, as células tumorais ativam mecanismos de malignidade tais como “switch” metabólico, angiogénese e invasão. Desta forma as células adquirem vantagem clonal e capacidade migratória para invadirem zonas de tecido cerebral saudável. Para além do incremento da malignidade, a elevada capacidade invasiva destas células constitui um risco em termos de recorrência. De um modo geral, a hipóxia integra-se como um marcador de mau prognostico. Para este estudo, duas linhas celulares obtidas através de biópsias de pacientes com GBM (UP-029 e SEBTA-023), foram incubadas a diferentes tempos de hipóxia. Após extração de ácido ribonucleico (ARN), realizou-se um microarray de perfil de hipóxia a três amostras em diferentes condições: normóxia (controlo), 6 e 48 horas. O método do microarray baseia-se na tecnologia de reações de polimerase em cadeia e em tempo real (RT-PCR). Este, por sua vez, é um método de quantificação de expressão génica através da geração de cópias (por ciclo de PCR) a partir de um ADN molde. Isto origina uma correlação entre a quantidade inicial de cópias e a quantidade acumulada a cada ciclo. Desta maneira, foi possível quantificar a expressão génica de 84 genes previamente descritos na literatura como relacionados na resposta hipóxica em diversos tipos de cancro. Este ensaio permitiu-nos identificar em larga escala diversos marcadores de hipóxia que foram diferencialmente expressos com significância. Do painel analisado, destacaram-se os genes ANGPTL4, NDRG1, CAIX, PFKB4 e VEGFA como relevantemente induzidos tanto nas UP-029 como nas SEBTA-023. Para além destes, os genes MXI1, HNF4A e TFRC foram estabelecidos como significativamente sub-expressos durante a hipóxia nas duas linhas celulares de GBM. Continuando com a análise, estudámos através de ensaios de RT-PCR quantitativo os vários genes distinguidos acima, tal como outros apenas diferencialmente expressos numa das linhas celulares durante a hipóxia. Cada gene foi analisado em quatro condições diferentes: normóxia, 6, 24 e 48 horas de hipóxia, em pelo menos três corridas diferentes. O método de 2-ΔΔCT foi usado para calcular o fold-change de cada gene, que nos transmite a magnitude biológica da expressão de um gene relativamente a um controlo. De modo a estudar a significância estatística dos resultados, usámos Students T-test (tipo 2, cauda 2) para calcular os P-values de cada amostra. Considerámos três níveis de significância para P-values inferiores que 0.05 (*), 0.01 (**) e 0.001 (***). Desta análise de RT-PCR quantitativo, para além dos genes previamente distinguidos, também os genes PIGF, PDK1, PFKB3, BNIP3, DDIT4 e SLC16A3 foram detetados como significativamente induzidos nas linhas celulares UP-029 e SEBTA-023. Validámos, também, o gene TFRC como significativamente subexpresso durante a hipóxia. De modo a analisar a expressão de proteínas de alguns deste fatores, realizaram-se ensaios de Western-blot. Esta é uma técnica vastamente usada em laboratório que permite a identificação de proteínas específicas de uma amostra de proteína total. Este método consiste na separação de proteínas por pesos moleculares através da aplicação de voltagem. Para tal, a amostra proteica é desnaturada através de calor e posteriormente pipetada num gel de eletroforese. As proteínas (carga negativa) migram através do gel na direção do polo positivo, assim que aplicada voltagem. Desta forma, as moléculas menores migram mais rapidamente e facilmente para a base do gel que as de maior peso molecular, que ficam mais próximas do topo. Após separação e transferência para uma membrana de nitrocelulose, é possível sinalizar estas proteínas através de complexos de anticorpos e fluoróforos. Assim, pudemos detetar a expressão proteica de alguns genes de interesse em diferentes condições: normóxia, 1, 2, 3, 6, 24 e 48 horas de hipóxia. Realizou-se uma análise de expressão proteica de HIF1a para confirmar a indução da resposta hipóxica. Uma vez que é regulado a nível da proteína, foram detetadas, de facto, bandas de HIF1a durante a hipóxia , apesar de não se observarem induções significantes da expressão génica. Como CAIX, foi significativamente expresso a nível do gene, foram também realizados blots para a proteína correspondente. A proteína CAIX foi detetável nas amostras de 6, 24 e 48 horas de hipóxia, especialmente nas células SEBTA-023. A proteína EGFR, vastamente descrita em GBM, foi também analisada. Curiosamente não foi detetável nas células UP-029, mas sim nas SEBTA-023, em todas as amostras. À semelhança de EGFR, os blots das proteínas UpaR, VEGFC e S100A10 foram também analisados. As proteínas UpaR e S100A10 foram detetadas em ambas as linhas celulares, com distinção nas amostras SEBTA-023. Nas células UP-029 a baixa deteção de proteína pode-se justificar por uma activação mais tardia da expressão de factores de invasão. Curiosamente a expressão de VEGFC, detetável em ambas as linhas, diminuí em simultaneidade com o aumento de horas de hipóxia. Em suma, o nosso estudo identificou ANGPTL4, NDRG1, CAIX, PFKB4, VEGFA, PIGF, PDK1, PFKB3, PFKB4, BNIP3, CAIX, DDIT4, NDRG1 e SLC16A3 como genes significativamente induzidos e HNF4A e TFRC como genes significativamente sub-expressos em GBM. Extrapolámos, que por vezes a indução das expressões de genes e proteínas de invasão é uma resposta tardia após um período considerado crónico de hipóxia. De futuro, deveriam ser estudados tempos de hipóxia mais prolongados, como 72 e 96 horas. Sugerimos, também, PFKB3 como um provável marcador de resistência à terapia, uma vez que já se encontra descrito noutros tumores, e neste estudo foi significativamente induzido. Conjuntamente, propõe-se o TFRC como um possível fator importante no impedimento da progressão do GBM, uma vez que foi sub-expresso nas diferentes análises. Estudos relativos a estes dois genes deverão ser conduzidos no futuro, para confirmar as hipóteses acima. Seria também relevante repetir este estudo aumentando o número de linhas celulares de modo a elevar a sensibilidade da seleção de possíveis novos marcadores de invasão em hipóxia

Criptococose pulmonar: Pulmonary cryptococcosis

Introdução: A criptococose é uma micose sistêmica causada pela inalação de esporos viáveis do fungo Cryptococcus spp. As principais espécies em humanos são Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii, que se associam, respectivamente, às condições de imunodepressão celular e à infecção primária de indivíduos imunocompetentes. O pulmão é o sítio primário mais comum, logo após o sistema nervoso central.  Apresentação do caso: JMF, masculino, 39 anos, apresentava queixa de tosse produtiva associada a desconforto respiratório aos moderados esforços, há cerca de 04 meses. Portador de HIV, sem outras comorbidades. Ao exame físico, sinais vitais estáveis, ausculta pulmonar com diminuição do murmúrio vesicular à direita. Na tomografia computadorizada (TC) de tórax evidenciou-se múltiplas opacidades nodulares difusas e de tamanhos variados, com presença de broncograma aéreo. Paciente foi submetido a biópsia por agulha percutânea e a análise do anatomopatológico constatou Criptococose Pulmonar. Discussão: A Criptococose pulmonar era considerada uma afecção rara, quando a prevalência de imunossuprimidos aumentou consideravelmente no século XX, sobretudo devido a Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA). As manifestações clínicas são inespecíficas, variam desde infecção autolimitada até a disseminada, com meningoencefalite. O estado imunológico do paciente é o fator de risco e de prognóstico mais importante, influenciando tanto na evolução clínica quanto na abordagem terapêutica. Conclusão: Tendo em vista a similaridade dos sinais e sintomas com outras infecções pulmonares e ao potencial de gravidade da doença, principalmente em portadores de imunodeficiência, é de suma importância o diagnóstico precoce e o uso apropriado dos agentes antifúngicos para a redução da morbimortalidade

Síndrome de Adie: Adie's Syndrome

Introdução: A Síndrome de Adie-Homes é uma doença caracterizada pela presença de pupila tônica associada à diminuição ou ausência dos reflexos tendíneos profundos. É uma doença considerada típica de adultos jovens e apresenta uma etiologia comumente idiopática.A presença de alteração no tamanho das pupilas é uma das queixas mais comuns.  Apresentação do caso: Paciente do sexo feminino, 28 anos, admitida em Hospital Geral de Goiânia, apresentou há 1 mês quadro de cefaleia fronto-orbital a direita, associada a vesículas em mesma região, dolorosas, em queimação, com diagnóstico de herpes zóster. Após 2 semanas, notou que sua acuidade visual à direita para perto estava diminuída associado a fotofobia. Ao avaliar pupilas com lâmpada de fenda, observou-se anisocoria à direita. Ao instilar pilocarpina 0,125% em ambos os olhos, apenas a pupila direita contraiu.. Discussão: Embora a etiologia da doença não esteja totalmente elucidada, acredita-se que possa ocorrer processos imunomediado e infecções por vírus da herpes-zoster, parvovírus B19, Treponema pallidum. Atualmente, o tratamento ainda se baseia no uso de Pilocarpina 0,125% para diminuir o desconforto do paciente, podendo ser usado 2-4 vezes ao junto, em associação ao uso de óculos escuros em ambientes muito iluminados. Conclusão: A síndrome de Adie é rara e encontramos em sua apresentação clínica singularidades que difere de paciente a paciente. Nota-se que a síndrome tem correlação com diversas áreas médicas, o que faz com que seu diagnóstico ocorra através do oftalmologista, podendo ter sua suspeição diagnóstica através de outros especialistas como reumatologistas, infectologistas e até mesmo dermatologistas

SARS-CoV-2 introductions and early dynamics of the epidemic in Portugal

Genomic surveillance of SARS-CoV-2 in Portugal was rapidly implemented by the National Institute of Health in the early stages of the COVID-19 epidemic, in collaboration with more than 50 laboratories distributed nationwide. Methods By applying recent phylodynamic models that allow integration of individual-based travel history, we reconstructed and characterized the spatio-temporal dynamics of SARSCoV-2 introductions and early dissemination in Portugal. Results We detected at least 277 independent SARS-CoV-2 introductions, mostly from European countries (namely the United Kingdom, Spain, France, Italy, and Switzerland), which were consistent with the countries with the highest connectivity with Portugal. Although most introductions were estimated to have occurred during early March 2020, it is likely that SARS-CoV-2 was silently circulating in Portugal throughout February, before the first cases were confirmed. Conclusions Here we conclude that the earlier implementation of measures could have minimized the number of introductions and subsequent virus expansion in Portugal. This study lays the foundation for genomic epidemiology of SARS-CoV-2 in Portugal, and highlights the need for systematic and geographically-representative genomic surveillance.We gratefully acknowledge to Sara Hill and Nuno Faria (University of Oxford) and Joshua Quick and Nick Loman (University of Birmingham) for kindly providing us with the initial sets of Artic Network primers for NGS; Rafael Mamede (MRamirez team, IMM, Lisbon) for developing and sharing a bioinformatics script for sequence curation (https://github.com/rfm-targa/BioinfUtils); Philippe Lemey (KU Leuven) for providing guidance on the implementation of the phylodynamic models; Joshua L. Cherry (National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institutes of Health) for providing guidance with the subsampling strategies; and all authors, originating and submitting laboratories who have contributed genome data on GISAID (https://www.gisaid.org/) on which part of this research is based. The opinions expressed in this article are those of the authors and do not reflect the view of the National Institutes of Health, the Department of Health and Human Services, or the United States government. This study is co-funded by Fundação para a Ciência e Tecnologia and Agência de Investigação Clínica e Inovação Biomédica (234_596874175) on behalf of the Research 4 COVID-19 call. Some infrastructural resources used in this study come from the GenomePT project (POCI-01-0145-FEDER-022184), supported by COMPETE 2020 - Operational Programme for Competitiveness and Internationalisation (POCI), Lisboa Portugal Regional Operational Programme (Lisboa2020), Algarve Portugal Regional Operational Programme (CRESC Algarve2020), under the PORTUGAL 2020 Partnership Agreement, through the European Regional Development Fund (ERDF), and by Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT).info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Educomunicação, Transformação Social e Desenvolvimento Sustentável

Esta publicação apresenta os principais trabalhos dos GTs do II Congresso Internacional de Comunicação e Educação nos temas Transformação social, com os artigos que abordam principalmente Educomunicação e/ou Mídia-Educação, no contexto de políticas de diversidade, inclusão e equidade; e, em Desenvolvimento Sustentável os artigos que abordam os avanços da relação comunicação/educação no contexto da educação ambiental e desenvolvimento sustentável

COVID-19 symptoms at hospital admission vary with age and sex: results from the ISARIC prospective multinational observational study

Background: The ISARIC prospective multinational observational study is the largest cohort of hospitalized patients with COVID-19. We present relationships of age, sex, and nationality to presenting symptoms. Methods: International, prospective observational study of 60 109 hospitalized symptomatic patients with laboratory-confirmed COVID-19 recruited from 43 countries between 30 January and 3 August 2020. Logistic regression was performed to evaluate relationships of age and sex to published COVID-19 case definitions and the most commonly reported symptoms. Results: ‘Typical’ symptoms of fever (69%), cough (68%) and shortness of breath (66%) were the most commonly reported. 92% of patients experienced at least one of these. Prevalence of typical symptoms was greatest in 30- to 60-year-olds (respectively 80, 79, 69%; at least one 95%). They were reported less frequently in children (≤ 18 years: 69, 48, 23; 85%), older adults (≥ 70 years: 61, 62, 65; 90%), and women (66, 66, 64; 90%; vs. men 71, 70, 67; 93%, each P < 0.001). The most common atypical presentations under 60 years of age were nausea and vomiting and abdominal pain, and over 60 years was confusion. Regression models showed significant differences in symptoms with sex, age and country. Interpretation: This international collaboration has allowed us to report reliable symptom data from the largest cohort of patients admitted to hospital with COVID-19. Adults over 60 and children admitted to hospital with COVID-19 are less likely to present with typical symptoms. Nausea and vomiting are common atypical presentations under 30 years. Confusion is a frequent atypical presentation of COVID-19 in adults over 60 years. Women are less likely to experience typical symptoms than men

Determinants of the Use of Health and Fitness Mobile Apps by Patients With Asthma : Secondary Analysis of Observational Studies

Background: Health and fitness apps have potential benefits to improve self-management and disease control among patients with asthma. However, inconsistent use rates have been reported across studies, regions, and health systems. A better understanding of the characteristics of users and nonusers is critical to design solutions that are effectively integrated in patients' daily lives, and to ensure that these equitably reach out to different groups of patients, thus improving rather than entrenching health inequities. Objective: This study aimed to evaluate the use of general health and fitness apps by patients with asthma and to identify determinants of usage. Methods: A secondary analysis of the INSPIRERS observational studies was conducted using data from face-to-face visits. Patients with a diagnosis of asthma were included between November 2017 and August 2020. Individual-level data were collected, including age, gender, marital status, educational level, health status, presence of anxiety and depression, postcode, socioeconomic level, digital literacy, use of health services, and use of health and fitness apps. Multivariate logistic regression was used to model the probability of being a health and fitness app user. Statistical analysis was performed in R. Results: A total of 526 patients attended a face-to-face visit in the 49 recruiting centers and 514 had complete data. Most participants were <= 40 years old (66.4%), had at least 10 years of education (57.4%), and were in the 3 higher quintiles of the socioeconomic deprivation index (70.1%). The majority reported an overall good health status (visual analogue scale [VAS] score>70 in 93.1%) and the prevalence of anxiety and depression was 34.3% and 11.9%, respectively. The proportion of participants who reported using health and fitness mobile apps was 41.1% (n=211). Multivariate models revealed that single individuals and those with more than 10 years of education are more likely to use health and fitness mobile apps (adjusted odds ratio [aOR] 2.22, 95%CI 1.05-4.75 and aOR 1.95, 95%CI 1.12-3.45, respectively). Higher digital literacy scores were also associated with higher odds of being a user of health and fitness apps, with participants in the second, third, and fourth quartiles reporting aORs of 6.74 (95%CI 2.90-17.40), 10.30 (95%CI 4.28-27.56), and 11.52 (95%CI 4.78-30.87), respectively. Participants with depression symptoms had lower odds of using health and fitness apps (aOR 0.32, 95%CI 0.12-0.83). Conclusions: A better understanding of the barriers and enhancers of app use among patients with lower education, lower digital literacy, or depressive symptoms is key to design tailored interventions to ensure a sustained and equitable use of these technologies. Future studies should also assess users' general health-seeking behavior and their interest and concerns specifically about digital tools. These factors may impact both initial engagement and sustained use

Unraveling the genetic background of individuals with a clinical familial hypercholesterolemia phenotype

Familial hypercholesterolemia (FH) is a common genetic disorder of lipid metabolism caused by pathogenic/likely pathogenic variants in LDLR, APOB, and PCSK9 genes. Variants in FH-phenocopy genes (LDLRAP1, APOE, LIPA, ABCG5, and ABCG8), polygenic hypercholesterolemia, and hyperlipoprotein (a) [Lp(a)] can also mimic a clinical FH phenotype. We aim to present a new diagnostic tool to unravel the genetic background of clinical FH phenotype. Biochemical and genetic study was performed in 1,005 individuals with clinical diagnosis of FH, referred to the Portuguese FH Study. A next-generation sequencing panel, covering eight genes and eight SNPs to determine LDL-C polygenic risk score and LPA genetic score, was validated, and used in this study. FH was genetically confirmed in 417 index cases: 408 heterozygotes and 9 homozygotes. Cascade screening increased the identification to 1,000 FH individuals, including 11 homozygotes. FH-negative individuals (phenotype positive and genotype negative) have Lp(a) >50 mg/dl (30%), high polygenic risk score (16%), other monogenic lipid metabolism disorders (1%), and heterozygous pathogenic variants in FH-phenocopy genes (2%). Heterozygous variants of uncertain significance were identified in primary genes (12%) and phenocopy genes (7%). Overall, 42% of our cohort was genetically confirmed with FH. In the remaining individuals, other causes for high LDL-C were identified in 68%. Hyper-Lp(a) or polygenic hypercholesterolemia may be the cause of the clinical FH phenotype in almost half of FH-negative individuals. A small part has pathogenic variants in ABCG5/ABCG8 in heterozygosity that can cause hypercholesterolemia and should be further investigated. This extended next-generation sequencing panel identifies individuals with FH and FH-phenocopies, allowing to personalize each person’s treatment according to the affected pathway

Em busca de um horizonte : narrativas sobre educação, artes e resistência

"APRESENTAÇÃO - Os textos reunidos no livro Em busca de um Horizonte: narrativas sobre educação, arte e resistência foram inspirados nos debates realizados durante o evento VI Simpósio Internacional Horizontes Humanos, que aconteceu na Faculdade de Educação da Universidade de Brasília, em 2018. O livro está dividido em quatro partes: Resistências cotidianas para além da utopia, Demasiado humano: as diferentes linguagens artísticas e culturais, A educação como um horizonte, Educação ambiental e ancestralidade: para continuar caminhando. Apesar da divisão em seções (sempre arbitrária), as produções - bastante diversas nas temáticas, metodologias e referenciais teóricos adotados – compartilham um alinhamento ao adotar um posicionamento político em defesa da diversidade, dos direitos humanos, da ancestralidade, do meio ambiente, da educação com valores democráticos, dos saberes populares e das diferentes linguagens artísticas. Assim, o livro se apresenta como um convite à resistência em tempos atrozes. Os organizadores