Einfluss des Glykoproteins WNT5A auf das Apoptoseverhalten von Pankreaskarzinomzellen in vitro und In-vivo-Bildgebung von NIS-positiven Pankreaskarzinom-Xenografts in Nacktmäusen.

Die WNT-Familie umfasst mindestens 19 evolutionär hoch-konservierte, sezernierte, cysteinreiche Glykoproteine. WNT-Proteine werden abhängig von ihrer Fähigkeit Zellen zu transformieren in zwei Gruppen eingeteilt. WNT5A gehört zu den am besten untersuchten Vertretern der nicht-transformierenden WNT-Proteine. Als solches wird es klassischerweise mit den sog. nicht-kanonischen Signalwegen in Verbindung gebracht. In der Literatur finden sich divergierende Angaben zur Rolle von WNT5A bei der Progression maligner Tumore verschiedener Entitäten. So gilt WNT5A z.B. im Mamma- und Kolonkarzinom als Tumorsuppressor und Marker für eine günstige Prognose. Im Gegensatz zu diesen Beobachtungen konnte in Vorarbeiten der Arbeitsgruppe gezeigt werden, dass WNT5A die Progression des Pankreaskarzinoms fördert, und zwar über antiapoptotische, pro-migratorische und pro-invasive Effekte. Dabei aktivierte WNT5A überraschenderweise die kanonische Signalkaskade und nicht die nicht-kanonischen Signalwege. Ob WNT5A in Pankreaskarzinomzellen einen Einfluss auf den PCP-Signalweg bzw. auf SAPK/JNK hat, blieb bislang offen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die antiapoptotische Wirkung von WNT5A nicht auf Pankreaskarzinomzellen begrenzt ist. Zumindest in der Mammakarzinom-zelllinie MDA-MB-468 führte die Behandlung mit siWNT5A sowohl zu einer Erhöhung der basalen Apoptoserate als auch der TRAIL-induzierten Apoptose. Zudem konnte die antiapoptotische Wirkung von WNT5A auf Pankreaskarzinomzellen in Experimenten mit rekombinantem WNT5 bestätigt werden. Durch rekombinantes WNT5A konnte die Apoptoserate nach Behandlung der Zellen mit Gemcitabine, dem Standard-therapeutikum des fortgeschrittenen Pankreaskarzinoms, signifikant gesenkt werden. Darüber hinaus konnte eine Aktivierung von SAPK/JNK durch WNT5A in der Pankreaskarzinomzelllinie PaTu-8988t ausgeschlossen werden. Somit ist es wahrscheinlich, dass WNT5A seine Effekte auf das Pankreaskarzinom über die kanonische Signalkaskade vermittelt. Um die Eignung eines Kandidatengens wie WNT5A für neue therapeutische Strategien zu evaluieren reichen reine in vitro-Analysen nicht aus. Eine Strategie Targetgene in vivo zu untersuchen besteht darin, menschliche Tumorzellen, die stabil oder induzierbar das jeweilige Gen exprimieren, als Xenografts in athymische Nacktmäuse zu implantieren. Eine kontinuierliche Erfassung der Größenzunahme ist allerdings nur bei subkutanen Xenografts einfach durchführbar. Eine Darstellung von orthotopen Pankreaskarzinom-Xenografts in vivo ist mit herkömmlichen Techniken der Bildgebung bislang nicht möglich. Ein neuer Ansatz besteht darin, Tumorzellen stabil mit dem Natrium-Jodid-Symporter (NIS) zu transfizieren. Durch Schwanzvenen-Injektion von 99mTechnetium-Pertechnetat können dann die Xenografts in vivo mittels Szintigraphie/SPECT dargestellt werden. Dazu wurden im Rahmen dieser Doktorarbeit drei Pankreaskarzinomzelllinien stabil mit NIS transfiziert: Imim-Pc1 RV/NIS, PaTu-8988t pBig2R/WNT5A NIS und PaTu-8988t-pBig2R NIS. Mit allen drei Zelllinien wurden subkutane Xenografts in Nacktmäusen erstellt. Allerdings zeigten nur die Imim-Pc1-Xenografts ausreichendes Größen-wachstum, um eine erfolgreiche 99mTc-SPECT-Bildgebung durchzuführen. So konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass eine In-vivo-Bildgebung mittels 99mTc-SPECT von NIS-positiven Pankreaskarzinom-Xenografts möglich ist. Damit ist der Grundstein für das langfristige Ziel einer In-vivo-Bildgebung von orthotopen Pankreaskarzinom-Xenografts zur In-vivo-Targetgenevaluation gelegt

Funktionelle Analyse von CUX1 in tumorassoziierten Makrophagen des Pankreaskarzinoms

Das Adenokarzinom des Pankreas (PDAC) zeigt eine charakteristische Stromareaktion mit einer hohen Anzahl tumorinfiltrierender Makrophagen (TAM). Obwohl bekannt ist, dass eine hohe Anzahl von TAMs mit einer Verschlechterung der Prognose einhergeht, ist die Rolle dieses Zelltyps im Pankreaskarzinom nur teilweise verstanden. Mehrere Studien haben gezeigt, dass Makrophagen aus humanen und murinen Tumoren, u. a. auch PDAC, einen progressionsfördernden M2- oder alternativ aktivierten Phänotyp aufweisen. Der Transkriptionsfaktor CUX1 ist bekannt als wichtiger Mediator der Tumorprogression und ist assoziiert mit einer negativen Prognose. Die tumorfördernden Effekte von CUX1 wurden bisher vor allem seiner promigratorischen, proproliferativen und antiapoptotischen Wirkung in Tumorzellen zugeschrieben. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass CUX1 nicht nur von den Tumorzellen, sondern auch von den TAMs des PDAC exprimiert wird. Eine Analyse der CUX1-Expression in humanen Karzinomgeweben und einem genetischen Mausmodell des PDAC zeigten eine gesteigerte CUX1-Expression in Makrophagen aus Tumorgewebe. TGF-β, ein wichtiger Mediator der Tumorprogression, der in PDAC-Geweben stark exprimiert ist, wurde als Stimulator der CUX1-Expression in Makrophagen identifiziert. Mittels Überexpression und siRNA-vermitteltem Knockdown von CUX1 wurden eine Reihe von Zytokinen als durch CUX1 reprimiert identifiziert, welche mit dem im allgemeinen als antitumoral wirksamen M1-Phänotyp von Makrophagen assoziiert sind. Für zwei Zytokine, CCL5 und CXCL10, wurden die dieser Repression zugrunde liegenden Mechanismen durch Reporter-Assays, DNA-Pulldown-Experimente und Immunopräzipitationen weiter untersucht. CUX1 wurde als direkter Interaktionspartner von NF-κBp65 identifiziert, der dessen Bindung an die Zytokinpromotoren inhibiert. Darüber hinaus reduziert CUX1 die Acetylierung von NF-κB p65 an Lysin 310, vermutlich durch Rekrutierung von HDAC1. Passend zu diesen M1-antagonisierenden Effekten, inhibiert CUX1 in Makrophagen funktionell durch eine Veränderung sezernierter Zytokine die Attraktion von zytotoxischen T-Zellen und fördert die Angiogenese in vitro. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit CUX1 als wichtiger Modulator des Makrophagen-Phänotyps und der Makrophagen-Funktion sowie Antagonist der NF-κB-abhängigen Genexpression identifiziert. Dieses Wissen könnte zu einem besseren Verständnis der tumorfördernden Eigenschaften von Makrophagen beitragen und als neuer therapeutischer Ansatzpunkt dienen

Prädiktive und prognostische Marker in pankreatischen neuroendokrinen Neoplasien in vitro und in vivo

Bei pankreatischen neuroendokrinen Neoplasien (PNEN) handelt es sich um seltene Tumoren, die von den endokrinen Zellen des Pankreas ausgehen. Biomarker, welche eine effektive Selektion geeigneter Patienten für bestimmte systemische Chemotherapien ermöglichen, sowie Marker von prognostischer Relevanz fü den Therapieverlauf sind jedoch nur unzureichend beschrieben. Daher war das Ziel dieser Arbeit, sowohl in vitro, im Xenograft-Mausmodell als auch in humanen Geweben mögliche prognostische und prädiktive Biomarker zu identifizieren und zu evaluieren. Im Fokus stand hierbei der Transkriptionsfaktor CUX1, dessen Genprodukt in malignen Zellen Gene reguliert, die für proproliferative, antiapoptotische und motilitätsfördernde Prozesse von Bedeutung sind. Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe belegten eine signifikant gesteigerte CUX1-Expression in invasiven humanen Insulinomen. In stabil CUX1-überexprimierenden Bon1-Zelllinien konnten in vitro proproliferative, antiapoptotische und proangiogene Eigenschaften von CUX1 gezeigt werden. In der vorliegenden Arbeit wurden im Xenograft-Modell der Maus die tumorfördernden Eigenschaften von CUX1 bestätigt. CUX1-üerexprimierende Tumoren zeigten immunhistochemisch eine signifikant gesteigerte Proliferationsrate. Basierend auf diesen in vitro und in vivo Befunden im Mausmodell war es ein weiteres Ziel der Arbeit, die prognostische Relevanz des Transkriptionsfaktors CUX1 bei Patienten mit PNEN zu evaluieren, welche als systemische Chemotherapie eine Behandlung mit 5-Fluoruracil (5-FU)- bzw. Dacarbacin (DTIC) erhalten hatten. Eine hohe CUX1-Expression war bei Patienten mit 5-FU-basierter Therapie mit einem signifikant kürzeren progressionsfreien Überleben (PFS) vergesellschaftet. Jedoch war in dieser Kohorte weder zwischen dem Proliferationsindex Ki-67 noch dem Gesamtüberleben eine Korrelation mit der CUX1-Expression zu beobachten. Hieraus ergab sich als weitere Fragestellung, inwieweit CUX1, unabhängig von den Effekten auf die Proliferationsrate, Resistenzmechanismen gegen zytotoxische Chemotherapien induziert. Hierzu wurden potenziell CUX1-abhängige miRNAs und Enzyme, die in den Metabolismus der Chemotherapeutika eingreifen können, untersucht. Es konnten jedoch keine miRNAs identifiziert werden, die klar durch CUX1 reguliert werden. Ebenso wenig zeigten die Enzyme Thymidylatsynthase (TS), Dihydropyrimidin-Dehydrogenase (DPD) und O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase (MGMT) eine CUX1-abhängige Regulation. Aufgrund von Literaturdaten, dass die letztgenannten Enzyme für andere Tumorentitäten prognostische und prädiktive Aussagekraft besitzen, wurde deren Expression und Relevanz auch an Gewebeproben einer PNEN-Kohorte evaluiert. Die erhöhte DPD-Expression war signifikant mit einer erhöhten objektiven Ansprechrate (ORR) korreliert, zeigte allerdings keine Verlängerung des mittleren progressionsfreien Überlebens (mPFS), während die TS neben einem signifikant gesteigerten mPFS auch einen Trend zu einer besseren Krankheitskontrolle aufwies. Die MGMT hingegen war bei Patienten, die eine DTIC-basierte Therapie erhalten hatten, ohne prognostischen oder prädiktiven Wert. Die potentiellen Biomarker, welche in dieser Arbeit beschrieben wurden, sollten in prospektiven Studien weiter evaluiert werden