Allele-specific knockout by CRISPR/Cas to treat autosomal dominant retinitis pigmentosa caused by the G56R mutation in NR2E3

La rétinite pigmentaire (RP) est une dystrophie rétinienne héréditaire qui entraîne une perte progressive de la vision. La deuxième mutation la plus courante associée à une RP autosomique dominante (ad) est la mutation G56R dans NR2E3, un facteur de transcription essentiel pour le développement des photorécepteurs. NR2E3 agit en favorisant la différentiation des bâtonnets tout en bloquant l'expression des gènes des cônes. Le variant G56R est exclusivement responsable de tous les cas d’adRP associées à NR2E3. Le développement d’un traitement pour l'adRP associée au gène NR2E3 serait donc applicable à tous les patients. Actuellement, il n'existe pas de traitement pour les adRP liées à NR2E3 ou d’autre gène, mais l'édition génomique est une stratégie prometteuse. Bien que l'approche la plus simple soit la correction de l'allèle mutant, cela représente un défi clinique pour les photorécepteurs, car ils n'utilisent pas la voie de réparation dirigée par homologie. Par conséquent, une approche plus pertinente consisterait à invalider spécifiquement l'allèle mutant dominant afin que l'allèle sauvage puisse fonctionner sans entrave.Pour mon projet de thèse, j'ai reprogrammé des fibroblastes d'un patient G56R en cellules souches pluripotentes induites (iPSC) que j'ai caractérisées. J'ai également développé une stratégie d’édition génomique utilisant le système CRISPR/Cas pour invalider spécifiquement l'allèle mutant G56R de NR2E3. Cela a été réalisé en concevant des gRNA qui couvrent le site de mutation et ne reconnaissent pas l'allèle sauvage (wild type, WT). J'ai réalisé une étude de preuve de concept dans les iPSC G56R démontrant l’invalidation spécifique de l'allèle G56R mutant en l'absence d'événements hors cible. De plus, nous avons validé cette stratégie de knockout dans un système de surexpression exogène. En conséquence, la protéine G56R-CRISPR mutante a été tronquée et mal localisée dans le cytosol, contrairement à la localisation périnucléaire de la protéine WT NR2E3. De façon intéressante, la localisation de la protéine G56R NR2E3 a été préférentiellement dans le noyau par rapport à la localisation périnucléaire prédominante de la protéine WT NR2E3.En outre, je montre pour la première fois que les iPSC G56R, ainsi que G56R-CRISPR, peuvent se différencier en organoïdes rétiniens matures. Ces organoïdes expriment des marqueurs de photorécepteurs de base tels que la rhodopsine, l’arrestine et les opsines de cône et ne montrent pas de signes de dégénérescence des bâtonnets jusqu'à 230 jours. Néanmoins, des données préliminaires suggèrent que les organoïdes G56R présentent des défauts d'expression de GNB1, ARL13 et ABCA4 par rapport aux organoïdes WT. Il est intéressant de noter que ces défauts n'étaient pas présents dans les organoïdes G56R-CRISPR2 testés. Un nombre plus élevé d'organoïdes sera nécessaire pour vérifier ces données.Dans l'ensemble, je démontre que le knockout spécifique de l'allèle G56R par CRISPR/Cas pourrait être une approche cliniquement pertinente pour traiter l'adRP associée au NR2E3.Retinitis pigmentosa (RP) is an inherited retinal dystrophy that causes progressive vision loss. The second most common mutation causing autosomal dominant (ad) RP is the G56R mutation in NR2E3, a transcription factor essential for photoreceptor development. NR2E3 acts to promote rod differentiation while blocking the expression of cone genes. The G56R variant is exclusively responsible for all cases of NR2E3-associated adRP. Thus, a potential treatment for NR2E3-realted adRP would be applicable to all patients. Currently, there is no treatment for NR2E3-related, or other, adRP, but genome editing holds promise. Although the most straightforward approach to genome editing would be correction of the mutant allele, this is clinically challenging in photoreceptors, because they do not use the Homology-Directed Repair pathway. Therefore, a more pertinent approach would be to specifically knockout the dominant mutant allele so that the wild type allele can perform unhindered.For my thesis project, I reprogrammed fibroblasts from a G56R patient to iPSCs which I characterized. I also developed a CRISPR/Cas strategy to specifically knockout the mutant G56R allele of NR2E3. This was achieved by designing gRNAs that span the mutational site and do not recognize the wild type (WT) allele. I performed a proof-of-concept study in G56R iPSC demonstrating allele-specific knockout of the mutant G56R allele in the absence of off-target events. Furthermore, we validated this knockout strategy in an exogenous overexpression system. Accordingly, the mutant G56R-CRISPR protein was truncated and mis-localized to the cytosol in contrast to the (peri)nuclear localizations of WT NR2E3 protein. Interestingly, G56R NR2E3 was preferentially localized in the nucleus compared to the predominant perinuclear localization of WT NR2E3.In addition, I show for the first time that G56R iPSC, as well as G56R-CRISPR iPSC, can differentiate into mature retinal organoids. These organoids express basic photoreceptor markers such as rhodopsin, cone arrestin and cone opsins, and do not show signs of rod degeneration up to 230 days. However, my preliminary data suggest that G56R organoids have defective expression of GNB1, ARL13 and ABCA4 compared to WT organoids. Interestingly, these defects were not present in G56R-CRISPR2 organoids. A higher number of retinal organoids is needed to confirm this data.Overall, I demonstrate that G56R allele-specific knockout by CRISPR/Cas could be a clinically relevant approach to treat NR2E3-associated adRP

Genome Editing as a Treatment for the Most Prevalent Causative Genes of Autosomal Dominant Retinitis Pigmentosa

Inherited retinal dystrophies (IRDs) are a clinically and genetically heterogeneous group of diseases with more than 250 causative genes. The most common form is retinitis pigmentosa. IRDs lead to vision impairment for which there is no universal cure. Encouragingly, a first gene supplementation therapy has been approved for an autosomal recessive IRD. However, for autosomal dominant IRDs, gene supplementation therapy is not always pertinent because haploinsufficiency is not the only cause. Disease-causing mechanisms are often gain-of-function or dominant-negative, which usually require alternative therapeutic approaches. In such cases, genome-editing technology has raised hopes for treatment. Genome editing could be used to (i) invalidate both alleles, followed by supplementation of the wild type gene, (ii) specifically invalidate the mutant allele, with or without gene supplementation, or (iii) to correct the mutant allele. We review here the most prevalent genes causing autosomal dominant retinitis pigmentosa and the most appropriate genome-editing strategy that could be used to target their different causative mutations