Quantification of DNA-associated proteins inside eukaryotic cells using single-molecule localization microscopy

Development of single-molecule localization microscopy techniques has allowed nanometre scale localization accuracy inside cells, permitting the resolution of ultra-fine cell structure and the elucidation of crucial molecular mechanisms. Application of these methodologies to understanding processes underlying DNA replication and repair has been limited to defined in vitro biochemical analysis and prokaryotic cells. In order to expand these techniques to eukaryotic systems, we have further developed a photo-activated localization microscopy-based method to directly visualize DNA-associated proteins in unfixed eukaryotic cells. We demonstrate that motion blurring of fluorescence due to protein diffusivity can be used to selectively image the DNA-bound population of proteins. We designed and tested a simple methodology and show that it can be used to detect changes in DNA binding of a replicative helicase subunit, Mcm4, and the replication sliding clamp, PCNA, between different stages of the cell cycle and between distinct genetic backgrounds

Etude d'une interaction protéine-protéine par ingénierie et marquages chimiques

Les travaux de recherche réalises au cours de cette thèse au sein du département d'ingénierie et d'étude des protéines du CEA/SACLAY, sont situés à l'interface de la chimie et de la biologie. En effet, l'objectif a été de concevoir, développer, puis exploiter de nouveaux outils chimiques pour l'étude structurale d'une protéine membranaire essentielle à la communication intercellulaire au niveau des jonctions neuromusculaires et du système nerveux. Cette protéine, le récepteur nicotinique de l'acétylcholine (NACHR), est impliquée dans un certain nombre de myopathies et de pathologies du système nerveux. Elle est également la cible de peptides antagonistes toxiques, issus de divers venins, qui se lient de manière quasi-irréversible au site du neurotransmetteur. Comme la plupart des protéines membranaires, cette macromolécule n'a pu être cristallisée et sa structure tridimensionnelle n'est pas connue. De nombreuses disciplines, telles que la biologie moléculaire, la microscopie électronique, l'électrophysiologie ou bien les techniques de marquage chimique ont été largement utilisées afin d'en proposer un modèle. Au cours de cette thèse, le marquage chimique a été particulièrement aborde grâce a une nouvelle génération de sondes obtenue par ingénierie chimique de la toxine de naja nigricollis. Jusqu'à présent, les toxines extraites de venins étaient statistiquement mono modifiées sur les résidus lysines. Dans notre cas, des analogues de la toxine, modifies en un site prédétermine, ont été synthétisés sur support solide en remplaçant un acide amine du site toxique par un résidu cystéine. Cet acide amine peut alors être aisément couple à un réactif spécifique des fonctions thiols. Ainsi, deux types de groupements électrophiles ont pu être greffes régiospécifiquement sur la toxine grâce a des synthons bifonctionnels. Le premier, homobifonctionnel, est de type bis-maléimide. Le deuxième, hétérobifonctionnel, est couple à la toxine par l'intermédiaire d'un pont disulfure et porte un groupement photoactivable de type aryldiazonium. Des expériences de marquage d'affinité, réalisés a l'aide de 15 sondes de type maléimide, sur le récepteur réduit régiospécifiquement ont permis d'affiner le modèle d'interaction moléculaire toxine-récepteur : un pont disulfure implique dans la fixation du neurotransmetteur a été localise par rapport a la toxine, positionnant dans l'espace des résidus importants du récepteur par rapport a un antagoniste de nature protéique. Ces résultats ont apporte une information essentielle a l'identification de l'empreinte du site toxique du ligand sur le récepteur. Par la suite, d'autres indices pourront être obtenus par marquage de photoaffinité grâce à l'utilisation de nouveaux outils performants. Ainsi, de nouveaux résultats devraient permettre de contraindre des modèles de structure tridimensionnelle de la protéine membranaire.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocPARIS-Museum Hist.Naturelle (751052304) / SudocSudocFranceF

L'aromathérapie dans la prise en charge des troubles urinaires (conseils à l'officine)

Les huiles essentielles sont -des produits odorants, généralement de composition complexe, obtenus à partir d'une matière première végétale botaniquement définie, soit par entraînement à la vapeur d'eau, soit par expression. L'objectif de ce travail est de faire un état des lieux sur les huiles essentielles utiles dans la prise en charge des troubles urinaires et de déterminer quels peuvent être les conseils en aromathérapie délivrés par le pharmacien d'officine. Après une première partie générale concernant les huiles essentielles et le système urinaire, les différentes pathologies urinaires et leurs diagnostics sont traités. Il s'agit des troubles urinaires liés à une infection : la cystite, la pyélonéphrite et la prostatite, ceux liés à une perte urinaire : l'énurésie et l'incontinence, et ceux liés à l'obstruction des voies urinaires : les calculs urinaires et l'hypertrophie bénigne de la prostate. Les solutions proposées par la médecine conventionnelle sont aussi décrites, en précisant les posologies, les éventuels effets indésirables et leurs contre-indications. Pour chacun des troubles urinaires, les huiles essentielles indiquées sont détaillées avec leurs caractéristiques botaniques, leurs propriétés thérapeutiques, et leurs mécanismes d'action quand ils sont connus. Leurs utilisations en pratique : les posologies, les voies d'administration, les précautions d'emploi et les contre-indications sont abordées afin de guider le conseil en aromathérapie du pharmacien d'officine et des fiches synthétiques ont été élaborées pour chacune des pathologies traitées. L'aromathérapie permet donc au pharmacien d'élargir ses conseils face à un patient ayant des troubles urinairesLYON1-BU Santé (693882101) / SudocSudocFranceF

Stabilization of Thiolate-Protected Gold Clusters Against Thermal Inversion: Diastereomeric Au₃₈(SCH₂CH₂Ph)_24–2x(R-BINAS)_x

Intrinsically chiral thiolate-protected gold clusters were recently separated into their enantiomers and their circular dichroism (CD) spectra were measured. Introduction of the chiral R-1,1'-binaphthyl-2,2'-dithiol (BINAS) into the ligand layer of rac-Au38(2-PET)24 clusters (2-PET: 2-phenylethylthiolate, SCH2CH2Ph) was shown to be diastereoselective. In this contribution, we isolated and characterized the diastereomeric reaction products of the first exchange step, A-Au38(2-PET)22(R-BINAS)1 and C-Au38(2-PET)22(R-BINAS)1 (A/C, anti-clockwise/clockwise) and the second exchange product, A-Au38(2-PET)20(R-BINAS)2. The absorption spectra show minor, but significant influence of the BINAS ligand. Overall, the spectra are less defined compared to Au38(2-PET)24, which is ascribed to symmetry breaking. The CD spectra are similar to those of the parent Au38(2-PET)24 enantiomers, readily allowing the assignment of handedness of the ligand layer. Nevertheless, some characteristic differences are found between the diastereomers. The anisotropy factors are slightly lower after ligand exchange. The second exchange step seems to confirm the trend. Inversion experiments were performed and compared to the racemization of Au38(2-PET)24. It was found that the introduction of the BINAS ligand effectively stabilizes the cluster against inversion, which involves a rearrangement of the thiolates on the cluster surface. It therefore seems that introduction of the di-thiol reduces the flexibility of the gold-sulfur interface

A Cysteine-Linkable, Short Cleavable Photoprobe with Dual Functionality To Explore Protein−Protein Interfaces

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Stabilization of Thiolate-Protected Gold Clusters Against Thermal Inversion: Diastereomeric Au₃₈(SCH₂CH₂Ph)_{24–2<i>x</i>}(<i>R</i>‑BINAS)_<i>x</i>

Intrinsically chiral thiolate-protected gold clusters were recently separated into their enantiomers, and their circular dichroism (CD) spectra were measured. Introduction of the chiral <i>R</i>-1,1′-binaphthyl-2,2′-dithiol (BINAS) into the ligand layer of <i>rac</i>-Au₃₈(2-PET)₂₄ clusters (2-PET: 2-phenylethylthiolate, SCH₂CH₂Ph) was shown to be diastereoselective. In this contribution, we isolated and characterized the diastereomeric reaction products of the first exchange step, <i>A</i>-Au₃₈(2-PET)₂₂(<i>R</i>-BINAS)₁ and <i>C</i>-Au₃₈(2-PET)₂₂(<i>R</i>-BINAS)₁ (<i>A</i>/<i>C</i>, anticlockwise/clockwise) and the second exchange product, <i>A</i>-Au₃₈(2-PET)₂₀(<i>R</i>-BINAS)₂. The absorption spectra show minor, but significant influence of the BINAS ligand. Overall, the spectra are less defined as compared to Au₃₈(2-PET)₂₄, which is ascribed to symmetry breaking. The CD spectra are similar to those of the parent Au₃₈(2-PET)₂₄ enantiomers, readily allowing the assignment of handedness of the ligand layer. Nevertheless, some characteristic differences are found between the diastereomers. The anisotropy factors are slightly lower after ligand exchange. The second exchange step seems to confirm the trend. Inversion experiments were performed and compared to the racemization of Au₃₈(2-PET)₂₄. It was found that the introduction of the BINAS ligand effectively stabilizes the cluster against inversion, which involves a rearrangement of the thiolates on the cluster surface. It therefore seems that introduction of the dithiol reduces the flexibility of the gold–sulfur interface

Quantification of titanium and zirconium elements in oral mucosa around healthy dental implants : a case-control pilot study

Objectives: Metallic particles are detected in different sites of the oral cavity, mainly in patients with peri-implantitis lesions. The aim of this pilot study was to analyze the levels of titanium and zirconium elements in the oral mucosa around healthy implants and to investigate the impact of titanium exogenous contamination on the measurements. Materials and methods: Forty-one participants were included in this three-phase study. Two groups of subjects were defined according to presence of titanium or zirconia implants (n: 20) or without any implants nor metallic restorations (n:21). Thirteen patients (n: 5 with zirconia implant; n: 3 with titanium implants; n: 5 control group) took part to the first part designed to optimize and validate the method of detecting titanium (Ti) and zirconium (Zr) elements in the oral mucosa and gingival tissues by the Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (ICPMS). The second phase compared the levels of Ti and Zr concentrations in patients with implants (n: 12) and without implants (n: 6) who were controlled for their intake of titanium dioxide (TiO2). The last step included ten control subjects without any metallic devices to measure the concentration of Ti and Zr before and after having candies containing TiO2. Results: In the first phase, concentrations of Ti and Zr were below the limit of detection (LOD) in most cases, 0.18 μg/L and 0.07 μg/L respectively. In the titanium group, two out of three subjects displayed concentrations above the LOD, 0.21 μg/L and 0.66 μg/L. Zr element was only found in patients with zirconia implants. After controlling the intake of TiO2, all concentrations of Ti and Zr were below the limit of quantification (LOQ). Moreover, in patients with no implants, the Ti concentration in gingiva cells was superior for 75% of the samples after having a TiO2 diet. Conclusions: Zirconium was only found in patients with zirconia implants, whereas titanium was detected in all groups even in subjects with no titanium implants. Zirconium and titanium elements were not detected in patients who were controlled for their intake of food and their use of toothpaste irrespective of the presence of implants or not. For 70% of the patients, the titanium detection was directly influenced by the intake of TiO2 contained candies. Clinical relevance: When analyzing titanium particles, it is necessary to pay attention to the risk of contamination bias brought by external products. When this parameter was controlled, no titanium particles were detected around clinically healthy implants.</p

Mass spectrometry strategies for venom mapping and peptide sequencing from crude venoms: Case applications with single arthropod specimen

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The venom of the snake genus Atheris contains a new class of peptides with clusters of histidine and glycine residues.

We investigated venoms from members of the genus Atheris (Serpentes, Viperidae), namely the rough scale bush viper (Atheris squamigera), the green bush viper (A. chlorechis) and the great lakes bush viper (A. nitschei), using mass spectrometry-based strategies, relying on matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) and electrospray ionisation tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS) with de novo peptide sequencing. We discovered a set of novel peptides with masses in the 2-3 kDa range and containing poly-His and poly-Gly segments (pHpG). Complete primary structural elucidation and confirmation of two sequences by Edman degradation indicated the consensus sequence EDDH(9)GVG(10). Bioinformatic investigations in protein sequence databanks did not show relevant homology with known peptides or proteins. However, a more extensive investigation of data in nucleic acid databases revealed some similarities to the precursor sequences of bradykinin potentiating peptides (BPP) and C-type natriuretic peptides (CNP), agents that are known to affect the cardiovascular system by acting on specific metalloproteases and receptors. The novel pHpG peptides found in Atheris venoms might also act on the cardiovascular system by inhibiting particular metalloproteases, which however remain to be identified

Relative Spatial Position of a Snake Neurotoxin and the Reduced Disulfide Bond α(Cys192-Cys193) at the αγ Interface of the Nicotinic Acetylcholine Receptor

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