Study of microsatellite instability, mismatch repair genes and mapk pathway in urinary bladder cancer

Aim of this study is the molecular and immunohistochemical study of urothelial bladder carcinomas, as well as the correlation with their clinicopathological characteristics and patients survival, in order to determine the potential association of these alterations in likely prognostic and diagnostic methods but also as means of follow-up of the disease. We studied MSI target genes TGF-βRII(A)₁₀, IGFIIR(G)₈, BAX(G)₈, caspase 5(Α)₁₀, hMSH3(A)₈ and hMSH6(G)₈ for the presence of mutations in their mononucleotide sequences and hMLH1, hMSH2 protein expression. We also analysed the presence of B-Raf gene mutations in relation to the activation of MAP kinase ERK. Molecular biology methods as well as immunohistochemistry were used in 152 tumor samples from patients with primary UC. At the present study 11 cases (16%) were mutated at TGF-βRII(A)₁₀, 1 case (3%) at BAX(G)₈ while no mutations were observed in caspase 5(A)₁₀, hMSH3(A)₈, hMSH6(G)₈ and IGFIIR(G)₈ by using PCR-SSCP and sequencing analysis. Nuclear hMLH1 and hMSH2 protein expression was found in 40/65 and 38/62 of the cases respectively by immunohistochemistry. Mutations in exon 15 of B-Raf gene were not detected in any of the examined cases. Nuclear or cytoplasmic immunoreactivity for pERK was detected in 99.3% (151/152) and 96.7% (147/152) of cases respectively. According to our results frameshift mutations at mononucleotide repeats in target genes of the microsatelhte instability pathway in urothelial carcinomas of the bladder are rarely observed in urinary bladder carcinogenesis in which the MSI pathway is rather uncommon. Nevertheless, hMLH1 protein expression is related to the presence of MSI and it is an important indicator for disease recurrence. Elevated pERK expression is observed in UCs in absence of B-Raf mutations. Interestingly, nuclear pERK expression parallels histologic grade and T-category in bladder UCs, implicating ERK activation in tumor invasiveness as well as in the acquisition of a more aggressive phenotype. These results speak in favor of the role of activated ERK as a molecular marker in the development of bladder cancer and encourage prospective investigations to validate the role of pERK as a therapeutic target in urothelial bladder cancer.Σκοπός της εργασίας αυτής είναι η μοριακή και ανοσοϊστοχημική μελέτη του ουροθηλιακού καρκινώματος της ουροδόχου κύστεως καθώς και η συσχέτιση των αποτελεσμάτων με τα κλινικοπαθολογοανατομικά χαρακτηριστικά των όγκων και την επιβίωση των ασθενών, με στόχο να αναζητηθεί η πιθανή προγνωστική τους αξία η οποία μπορεί να αξιοποιηθεί στη διάγνωση, την πρόβλεψη της εξέλιξης ή της υποτροπής της νόσου καθώς και στην ανάπτυξη νέων θεραπειών. Μελετήθηκαν οι μονο-νουκλεοτιδικές αλληλουχίες των γονιδίων-στόχων της μικροδορυφορικής αστάθειας TGF-βRII(A)₁₀, IGFIIR(G)₈, BAX(G)₈, κασπαση 5(Α)₁₀, hMSH3(A)₈ και hMSH6(G)₈ για την ύπαρξη μεταλλαγών και η έκφραση των πρωτεϊνών hMLH1 και hMSH2. Επιπλέον έγινε αναζήτηση της παρουσίας μεταλλαγών στο γονίδιο B-Raf και της ενεργοποίησης της MAP κινάσης ERK. Χρησιμοποιήθηκαν 152 δείγματα από ασθενείς με ουροθηλιακό καρκίνωμα ουροδόχου κύστεως, ενώ εφαρμόστηκαν μέθοδοι μοριακής βιολογίας και ανοσοϊστοχημείας. Παρατηρήθηκε σε 11 περιπτώσεις (16%) μεταλλαγή του γονιδίου TGF-βRII και σε 1 περίπτωση (3%) του γονιδίου ΒΑΧ. Αντιθέτως, δεν βρέθηκαν μεταλλαγές στις επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες των γονίδιων κασπάση 5(Α)₁₀, hMSH3(A)₈, hMSH6(G)₈ και IGFIIR(G)₈. Ανοσοϊστοχημικά εντοπίστηκε πυρηνική έκφραση της πρωτεΐνης hMLH1 σε 40/65 περιπτώσεις και της hMSH2 σε 38/62 περιπτώσεις. Δεν παρατηρήθηκε μεταλλαγή του γονίδιου B-Raf ενώ πυρηνική χρώση της πρωτεΐνης pERK παρατηρήθηκε σε ποσοστό 99.3% (151/152 περιπτώσεις) και κυτταροπλασματική σε 96.7% (147/152 περιπτώσεις). Μπορούμε λοιπόν να εξάγουμε τα παρακάτω συμπεράσματα: η απενεργοποίηση του μηχανισμού επιδιόρθωσης λανθασμένα ζευγαρωμένων βάσεων του DNA λόγω μεταλλαγής των γονιδίων επιδιόρθωσης που οδηγεί στην ανάπτυξη μικροδορυφορικής αστάθειας, εμπλέκεται σε μικρό ποσοστό στην καρκινογένεση της ουροδόχου κύστεως. Η μειωμένη έκφραση της πρωτεΐνης hMLH1 φαίνεται να σχετίζεται στενά με την παρουσία μικροδορυφορικής αστάθειας, ενώ αναδείχθηκε σημαντικός προγνωστικός παράγοντας όσον αφορά την επανεμφάνιση της νόσου. Παρατηρήθηκε αυξημένη έκφραση της ενεργοποιημένης MAP κινάσης ERK απουσία μεταλλαγών στο B-Raf. Η πυρηνική έκφραση της pERK αυξάνεται με το βαθμό διαφοροποίησης και την κατηγορία Τ του όγκου, υποδηλώνοντας ότι η ενεργοποίηση της πρωτεΐνης ERK ενδεχομένως οδηγεί σε πιο επιθετικό φαινότυπο στο ουροθηλιακό καρκίνωμα ουροδόχου κύστεως. Με αυτόν τον τρόπο αναδεικνύεται η έκφραση της πρωτεΐνης pERK ως μοριακός δείκτης στην καρκινογένεση της ουροδόχου κύστεως και η πιθανή σημασία της ως θεραπευτικός στόχος για τα ουροθηλιακά καρκινώματα

Integrated Hedgehog signaling is induced following castration in human and murine prostate cancers

BACKGROUND The interplay between androgen and Hedgehog (Hh) signaling pathways may be associated with prostate cancer progression and resistance to therapy. METHODS Tissue microarrays from prostatectomy specimens were derived from 53 patients treated preoperatively with androgen ablation (AA) with or without chemotherapy, and from 26 stage- and grade-matched controls. A previously characterized androgen-regulated human prostate cancer xenograft was used to conduct parallel murine studies. Expression of markers of interest was determined on both untreated and castrated tumors. RESULTS Four-month exposure to AA or AA with chemotherapy led to a uniform increase in Hh signaling as compared to controls, paired with an inverse trend of androgen receptor (AR) and CYP17 expression in clinically derived specimens. Changes in the expression profiles of Hh signaling were observed in the epithelium and stroma, in response to genotoxic stress of androgen ablation and chemotherapy. A reduced expression of KI67 and increased bcl2 expression was observed in the malignant epithelial compartment. CONCLUSION To our knowledge, this is the first clinical evidence that Hh signaling is induced by AA or the combination of AA and chemotherapy and, by inference, contributes to castrate-resistant progression of prostate cancer as supported by parallel human and murine studies. These data are in agreement with previous reports that implicate Hh signaling in castrate-resistant progression of prostate cancer. Based on these findings, we are pursuing parallel clinical and murine investigations to determine if Hh signaling inhibition combined with AA will be more effective than AA alone. Prostate 73: 153161, 2013. (c) 2012 Wiley Periodicals, Inc