Uurimustöö Saccharomyces cerevisiae tsükliinist sõltuva kinaasi Cdk1 substraadispetsiifilisusest ja multifosforüleerimise mehhanismist

Väitekirja elektrooniline versioon ei sisalda publikatsioone.Raku jagunemistsükkel ehk rakutsükkel on protsess, mille käigus rakk kahekordistab oma sisu ja seejärel jaguneb kaheks. Rakutsükli saab jagada neljaks erinevaks etapiks: G1-, S-, G2- ja M-faasiks. Võtmetähtsusega sündmused – DNA replikatsioon ja kromosoomide segregatsioon ning järgnev tsütoplasma jagunemine ̶ toimuvad vastavalt S- ja M-faasis. S- ja M-faas on teineteisest eraldatud vaheetappide ehk G1- ja G2-faasiga. Rakutsükli faaside vaheldumine on reguleeritud kontrollsüsteemi poolt, mille peamisteks komponentideks on tsükliinist sõltuvad kinaasid (cyclin-dependent kinase; CDK). CDK valkude aktiivsuse ostsillatsioon sõltub erinevate regulatoorsete subühikute ehk tsükliinide olemasolust erinevates rakutsükli etappides. Tsükliinid võib jaotada kolme klassi: G1-tsükliinid, mis seonduvad CDK-dega G1-faasis, S-faasi tsükliinid, mis kontrollivad DNA replikatsiooni, ja mitootilised ehk B-tüüpi tsükliinid, mis aktiveerivad CDK-d rakutsükli G2- ja M-faasis. CDK-de ensümaatilist aktiivsus reguleeritakse nelja erineva mehhanismi abil: tsükliini seondumine, aktiveeriv või inhibeeriv fosforüleerimine ja seondumine inhibiitorvalkudega. Aktiivsed tsükliin-Cdk kompleksid toimivad lülititena, lisades teistele valkudele fosfaatrühmi ning muutes seeläbi nende omadusi. Enamus substraatvalke sisaldavad mitmeid CDK poolt äratuntavaid fosforüleerimise konsensusjärjestusi S/T-P-x-K/R (kus x võibolla ükskõik milline aminohape), milles aminohapped seriin (S) või treoniin (T) käituvad fosfaadi aktseptorina. Lisaks kuulub tsükliin-Cdk kompleksi veel CDK adaptorvalk Cks, moodustades kolmikkompleksi tsükliin-Cdk-Cks. Cks võib seonduda juba fosforüleeritud valkudega, aidates kaasa substraatide multi-fosforüleerimisele. Üldiselt määravad tsükliin-Cdk-Cks komplekside substraadi spetsiifilisust kolm äratundmismotiivi: 1) Tsükliinil asuv hüdrofoobne tasku, mis interakteerub substraatidel oleva seondumismotiiviga, 2) CDK aktiivsait, mis seondub sihtmärkvalgu konsensusjärjestusega ja 3) Cks-e katioonne tasku, mis seondub juba fosforüleeritud sihtmärkvalkude fosfaatrühma ja ümbritseva konsensusjärjestusega. Üheks mudelorganismiks, kus rakutsükli toimimismehhanisme uurida, on pagari¬pärm Saccharomyces cerevisiae. Erinevalt imetajatest leidub S. cere¬visieae-s ainult üks tsükliinist sõltuv kinaas, Cdk1, mis interakteerub erinevatel rakutsükli etappidel üheksa erineva tükliiniga (Cln1–3 ja Clb1–6) ning adaptor¬valgu Cks1-ga. Tsükliinid Cln1-3 on aktiivsed G1 faasis ja G1/S faasi üle¬minekul. Clb5 ja 6 vastutavad korrektse S-faasi sisenemise ja läbimise eest. Clb3 ja Clb4 osalevad G2/M üleminekul. Clb1 ja Clb2 aga kontrollivad mitoo¬tiliste rakkude saatust. Käesoleva eksperimentaalse töö esimene osa keskendub küsimusele, kuidas muutub erinevate tsükliin-Cdk1 komplekside aktiivsus S. cerevisiae rakutsükli käigus. Kuna enamus CDK sihtmärkvalkudest sisaldavad mitmeid fosforüleerimisjärjestusi, siis keskendusime eksperimentaalse töö teises osas multifosforüleerimise mehhanismi detailsele uurimisele CDK inhibiitorvalgu Sic1-e näitel. B-tüüpi tsükliinide Clb-Cdk1 komplekside inhibiitori Sic1-e tase hakkab tõusma mitoosi lõpus ja valk püsib aktiivsena hilise G1 faasini, kus toimub Sic1-e fosforüleerimisest sõltuv lagundamine. Spetsiifilistest lagundamisjärjestustest ehk degronitest fosforüleeritud Sic1 ära tundmine toimub läbi Cdc4, mis on ubikuitiini ligaasi SCF-i (Skp1/Cdc53/F-box) spetsiifilisusfaktor. Ubikuitineeritud Sic1-e lagundamine toimub üle proteasoomi raja. Oma töös uurisime põhjalikult erinevate tsükliin-Cdk1 komplekside poolt läbiviidavat Sic1 fosforüleerimist. Eksperimentaalse töö kolmandas osas uurisime erinevaid parameetreid, mis mõjutavad Cdk1 poolt läbiviidavat substraatvalkude multifosforüleerimist. Elemendid, mis määravad tsükliin-Cdk1-Cks1-st sõltuva multifosforüleerimise on järgmised: distantsid erinevate fosforüleerimisjärjestuste vahel, tsükliini seodumisjärjestuste positsioon fosforüleerimissaitide suhtes, Cks1 konsensusjärjestuse erinev spetsiifika, seriini- ja treoniinijääkide esinemise suhe CDK konsensusjärjestustes ja iga fosforüleerimisetapi protsessiivsusfaktor.The cell cycle is the process by which cells duplicate their contents and then divide to produce a pair of daughter cells. The master regulators of the cell cycle are cyclin dependent kinases (CDKs). CDKs are activated by their perio¬dically accumulating regulatory partners, the cyclins. The enzymatic activity of cyclin-Cdk complexes is tightly controlled by a variety of mechanisms. Sub¬strate targeting by a given cyclin-Cdk complex is mediated by the active site on the CDK and docking sites on the cyclin subunits. Additionally, the presence of a phosphate-binding pocket on the CDK adaptor subunit Cks1 promotes inter¬action with targets containing multiple phosphorylation sites. In simple euka¬ryotes, such as budding yeast, a single CDK, Cdk1, enzyme associates with se¬veral different cyclins. The combination of rising levels of CDK activity and the distinct substrate specificities of different cyclin-Cdk complexes enables the tem¬porally ordered phosphorylation of the many target proteins that regulate cell cycle events. Robust inhibition of S-phase CDK activity in the G1 phase of the cell cycle is the major mechanism preventing uncontrolled onset of DNA replication. In budding yeast, S phase is switched on after the rapid proteolytic degradation of the Cdk1 inhibitor Sic1. Sic1 is a stoichometric inhibitor of Clb-Cdk1 comple¬xes. It appears at the end of mitosis, and its destruction at the G1/S boundary is induced by Cdk1-mediated multisite phosphorylation. The first part of the present dissertation provides an overview of cell cycle control systems, focusing on the different substrate specificities of the various cyclin-Cdk complexes. Next, the CDK inhibitors in yeast and mammalian cells are introduced. Finally, the role of Cks1 as a phosphate binding adaptor mole¬cule for CDK, and the functional implications of this role are reviewed. The original results presented here cover the following areas: a) studies and discus-sions on the changes in cyclin-Cdk1 substrate specificity during the cell cycle b) in vivo and in vitro characterization and analysis of multisite phosphorylation of Sic1, and c) characterization of the parameters promoting Cks1-mediated multi-site phosphorylation of Cdk1 targets

Õppimine ja väljalangemine IKT erialade esimesel aastal Eesti kõrgkoolide näitel

Loodusteaduste ja tehnoloogia valdkonnas on suureks probleemiks üliõpilaste väljalangemine IKT erialadelt. Siinse kvalitatiivse uurimuse eesmärk on mõista sügavamalt erinevusi väljalangenud ja edasiõppivate üliõpilaste vahel ning leida abinõud, mida saaks väljalangemuse vähendamiseks kasutusele võtta. Andmeid koguti intervjuudega kaheksalt väljalangenud ja kaheksalt õpinguid jätkanud üliõpilaselt. Tulemused näitavad, et iseseisev IKT õppimine enne kõrgkooli muudab õpingud kõrgkoolis lihtsamaks ning õpingute jätkamisele aitab kaasa tugevam akadeemiline ja sotsiaalne integratsioon. Erinevused väljalangenud ja õpinguid jätkanud üliõpilaste vahel ilmnevad vaid akadeemilise integratsiooni puhul. Seevastu eri õppevormides õppivate üliõpilaste erinevused seisnevad varasemates kogemustes, kõrgkooli astumise eesmärkides, õpingutele pühendumises ja sotsiaalses integratsioonis. Tulemuste põhjal saab esitada soovitusi IKT erialadelt väljalangemise ennetamiseks.  Summar

Info- ja kommunikatsioonitehnoloogia erialade tudengite õpingud kõrgkoolis: esimesel aastal väljalangemine ja õpingute jätkamine

Tööturul on hetkel suur puudujääk kõrgharidusega töötajatest ning seda eriti informatsiooni- ja kommunikatsioonitehnoloogia valdkonnas (IKT). Probleemi võimendab ka kõrge katkestamismäär kõrgkoolidest. Kaks kolmandikku Eesti IKT tudengitest jätavad oma õpingud pooleli ning seda just õpingute esimesel aastal või isegi esimesel semestril. Andmeid koguti poolstruktureeritud intervjuudega, vesteldes kaheksa teisel aastal õppiva ja kaheksa esimesel aastal väljalangenud IKT tudengiga erinevatelt erialadelt ja õppevormidelt. Tulemused näitavad, et õppivad ja väljalangenud tudengid astuvad kõrgkooli sarnaste eesmärkide ja ootustega. Lisaks leiti, et õpingute ajal töötamine on problemaatiline pigem kaugõppe tudengitele, kes täiskoormusega töökoha puhul satuvad koolitöödega tihtipeale ajahätta. Peamisteks katkestamise põhjusteks toodi vale erialavalik, ajapuudus ja õpimotivatsiooni kadumine. Seega on oluline pakkuda tudengitele erinevaid tugisüsteeme ja tingimusi, mis vähendaksid katkestamismäära IKT erialadelt

KULUANALÜÜSI ÜHTLUSTATUD MUDEL – ÜLESEHITUS JA KASUTUSVÕIMALUSED

Kuluanalüüs on pidev tegevus, mis saadab kuluobjekti kogu elutsükli vältel. Kuluanalüüs on ka meeskonnatöö, kus kuluobjekti elutsükli eri etappide analüüsil vajatakse erinevat oskusteavet. Kuluobjekti elutsükli vältel muutub selle kuluandmete koosseis, kättesaadavus, usaldusväärsus ja detailsus. Et kuluanalüüsid oleksid omavahel võrreldavad ja ristkasutatavad, peavad analüüsis kasutatavad and- med olema ühed ja samad. Andmeid on vaja ka regulaarselt uuendada ja täiendada. Seejuures peavad uuendamisreeglid olema selged ja kõigile kasutajatele arusaadavad ning oluline on seegi, et kasutajad neid aktsepteeriksid. Objekti kuluandmetel on praktiline tähendus ainult koos selle objekti sooritusandmetega ja ainult nende sooritusandmete kontekstis. Artikli esimeses osas kirjeldatakse riigikaitse planeeri- mise (kaitseplaneerimise) ja haldamise põhietappe, iga etapi iseloomulikku analüüsi- tegevust ning etappide võtmeosalejaid. Artikli teises osas põhjendatakse vajadust võtta kasutusele kuluanalüüsi ühtlustatud mudel (ingl cost breakdown structure) ning esitatakse ühtlustatud analüüsimudeli ülesehitus. Viimases, kolmandas osas paku- takse üks sihipärane võimalus tuleviku töövoo korraldamiseks kuluanalüüsi ühtlus- tatud mudeli kasutamisel

Bigfoot Cosmonaut

https://digitalcommons.ric.edu/as220_root/2059/thumbnail.jp

Keha staatiline tasakaal alaseljavaludega naistel: seosed selja sirutajalihaste jõu ja lülisamba seisundiga

http://www.ester.ee/record=b4435561~S

Pengaruh Kepemimpinan Transformasional dan Komitmen Organisasi terhadap Turnover Intention (Studi pada Hotel Ratu Mayang Garden Pekanbaru)

This study aims to analyze the effect of transformational leadership and organizational commitment toward turnover intention in Ratu Mayang Garden Hotel Pekanbaru. Transformational leadership as the first variable (X1), Organizational commitment as the second variable (X2), and turnover intention as the third variable (Y). The method in this research is descriptive and quantitative by using program of SPSS 21, where the sample used by 80 employees by census and technique of data collecting through questioner. The result of this analysis using test of validity, reliability test, determination, simple linear regression test, T test and F test so it can be concluded that transformational leadership have significant effect toward turnover intention, organizational commitment have significant effect toward turnover intention. Transformational leadership and organizational commitment have negative effect and significant toward turnover intention in Ratu Mayang Garden Hotel Pekanbaru

Pengaruh Strategi Pemasaran dan Kualitas Pelayanan Terhadap Kepuasan dan Dampaknya Terhadap Loyalitas Konsumen Daerah Wisata Tahura Lapak Jaru di Kabupaten Gunung Mas

This study aims to analyze the effect of marketing strategy on loyalty through the satisfaction of the tourist area of ​​Tahura Jaru in Gunung Mas Regency. The method used in this study is explanatory research. The sample of this study amounted to 75 people as respondents. The data were analyzed using descriptive analysis and statistical inferential analysis of the Structural Equation Modeling (SEM) using the Partial least squares approach (SEM-PLS). The results of the study conclude that marketing strategy affects loyalty either directly or through satisfaction. In this relationship satisfaction is a partial mediation (partial mediation). Service quality does not directly affect loyalty, but through satisfaction. In this relationship satisfaction is a full mediation variable (full mediation). Communication has a significant effect on performance either directly or indirectly

Maltase protein of <i>Ogataea </i>(<i>Hansenula</i>) <i>polymorpha </i>is a counterpart to resurrected ancestor protein ancMALS of yeast maltases and isomaltases

Saccharomyces cerevisiae maltases use maltose, maltulose, turanose and maltotriose as substrates, isomaltases use isomaltose, α‐methylglucoside and palatinose and both use sucrose. These enzymes are hypothesized to have evolved from a promiscuous α‐glucosidase ancMALS through duplication and mutation of the genes. We studied substrate specificity of the maltase protein MAL1 from an earlier diverged yeast, Ogataea polymorpha (Op), in the light of this hypothesis. MAL1 has extended substrate specificity and its properties are strikingly similar to those of resurrected ancMALS. Moreover, amino acids considered to determine selective substrate binding are highly conserved between Op MAL1 and ancMALS. Op MAL1 represents an α‐glucosidase in which both maltase and isomaltase activities are well optimized in a single enzyme. Substitution of Thr200 (corresponds to Val216 in S. cerevisiae isomaltase IMA1) with Val in MAL1 drastically reduced the hydrolysis of maltose‐like substrates (α‐1,4‐glucosides), confirming the requirement of Thr at the respective position for this function. Differential scanning fluorimetry (DSF) of the catalytically inactive mutant Asp199Ala of MAL1 in the presence of its substrates and selected monosaccharides suggested that the substrate‐binding pocket of MAL1 has three subsites (–1, +1 and +2) and that binding is strongest at the –1 subsite. The DSF assay results were in good accordance with affinity (K (m)) and inhibition (K (i)) data of the enzyme for tested substrates, indicating the power of the method to predict substrate binding. Deletion of either the maltase (MAL1) or α‐glucoside permease (MAL2) gene in Op abolished the growth of yeast on MAL1 substrates, confirming the requirement of both proteins for usage of these sugars. © 2016 The Authors. Yeast published by John Wiley & Sons, Ltd