Structure and function studies on the hERG potassium channel including the development and characterization of membrane mimetics

Les protéines membranaires, notamment eucaryotes, sont connues pour représenter un défi à étudier. Dans cette thèse, des méthodes ont été développées pour aider dans le domaine de recherche des protéines membranaires. Plus précisément, le but de cette thèse était de permettre l'étude de la structure et de la fonction des canaux potassiques voltage-dépendants par résonance magnétique nucléaire. Des membranes modèles pour l'analyse des protéines membranaires ont été développées et caractérisées. Deux types de bicelles ont été étudiés : les bicelles faites avec des phospholipides à courtes chaînes et celles constituées de détergents monoalkylphosphocholines (MAPCHO). Les bicelles couramment utilisées formées de dimyristoyl-phosphatidylcholine (DMPC ou D14PC) et de dihexanoyl-PC (DHPC ou D6PC) ont été étudiées afin de déterminer leur morphologie et leur miscibilité dans des conditions diluées. Les résultats indiquent les concentrations seuils de formation de ces agrégats, la frontière de rapport molaire DMPC / DHPC (q) entre bicelle et micelle mixte ainsi que les meilleures concentrations à utiliser. Afin d'améliorer la solubilisation des protéines membranaires et permettre leur étude en systèmes bicellaires, le DHPC a été remplacé par les détergents de la famille MAPCHO, dont la dodécylphosphocholine (DPC ou DPC12) est connue pour sa capacité à solubiliser les protéines membranaires. Par l'ajout progressif de phospholipides à des mélanges de tensioactifs et de protéines membranaires, la protéine membranaire pourrait être reconstituée dans un environnement bicellaire. Une étude systématique a été menée en variant la longueur de chaîne du phospholipide (C12 à C20) ainsi que du détergent (C12 à C16). Les résultats ont indiqué qu'il était possible de former des systèmes orientés magnétiquement pour six des douze mélanges binaires testés avec différentes épaisseurs de bicouche, à différents rapports molaires lipides / détergents (q) et différentes températures. La qualité de l'alignement, la miscibilité, les concentrations seuils de formation de ces agrégats ainsi que l'effet de l'ajout des ions lanthanides ou des lipides anioniques ont également été étudiés. Une tentative d'établir un critère empirique qui pourrait prédire si une paire donnée de tensioactif et de phospholipide formerait des bicelles a été discutée. Pour évaluer le potentiel de ces membranes modèles comme système de reconstitution directe, des peptides de canaux potassiques ont été solubilisés dans des micelles de DPC, suivi par l'addition de DMPC. Ce projet a permis d'obtenir des données intéressantes sur la structure et les interactions avec les membranes des hélices du pore de Kv1.5 et du human ether-a-go-go related gene (hERG). Un obstacle majeur dans la détermination de structure des protéines membranaires est l'absence de stratégie d'expression et de purification appropriée. La protéine hERG a été sélectionnée pour son implication dans une cardiopathie associée avec d'importants effets hors-cible de médicaments. Un protocole d'expression et de purification efficace du domaine du pore du hERG a été développé. Cela a permis d'obtenir des caractérisations biophysiques et des mesures électrophysiologiques préliminaires. Ces résultats fournissent des méthodes pour solubiliser les protéines membranaires afin de pouvoir les étudier, ainsi que pour réaliser l'expression et la purification du domaine du pore d'un important canal potassique eucaryote : le hERG, qui ouvre la voie à l'obtention de sa structure.\ud ______________________________________________________________________________ \ud MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Protéine membranaire, Canal potassique hERG, Membrane modèle, Bicelle, Détergent monoalkylphosphocholine, Résonance magnétique nucléaire

Single-channel electrophysiology of cell-free expressed ion channels by direct incorporation in lipid bilayers

Single-channel electrophysiology with lipid bilayer systems requires ion channel expression, purification from cell culture, and reconstitution in proteoliposomes for delivery to a planar bilayer. Here we demonstrate that single-channel current measurements of the potassium channels KcsA and hERGS5-S6 can be obtained by direct insertion in interdroplet lipid bilayers from microliters of a cell-free expression medium

Magnetically oriented bicelles with monoalkylphosphocholines: versatile membrane mimetics for nuclear magnetic resonance applications

Bicelles (bilayered micelles) are model membranes used in the study of peptide structure and membrane interactions. They are traditionally made of long- and short-chain phospholipids, usually dimyristoylphosphatidylcholine (D14PC) and dihexanoyl-PC (D6PC). They are attractive membrane mimetics because their composition and planar surface are similar to the native membrane environment. In this work, to improve the solubilization of membrane proteins and allow their study in bicellar systems, D6PC was replaced by detergents from the monoalkylphosphocholine (MAPCHO) family, of which dodecylphosphocholine (12PC) is known for its ability to solubilize membrane proteins. More specifically 12PC, tetradecyl- (14PC), and hexadecyl-PC (16PC) have been employed. To verify the possibility of making bicelles with different hydrophobic thicknesses to better accommodate membrane proteins, D14PC was also replaced by phospholipids with different alkyl chain lengths: dilauroyl-PC (D12PC), dipalmitoyl-PC (D16PC), distearoyl-PC (D18PC), and diarachidoyl-PC (D20PC). Results obtained by 31P solid-state nuclear magnetic resonance (NMR) and isothermal titration calorimetry (ITC) at several lipid-to-detergent molar ratios (q) and temperatures indicate that these new MAPCHO bicelles can be formed under a variety of conditions. The quality of their alignment is similar to that of classical bicelles, and the low critical micelle concentration (CMC) of the surfactants and their miscibility with phospholipids are likely to be advantageous for the reconstitution of membrane proteins

Metal Binding Properties of the N-Terminus of the Functional Amyloid Orb2

The cytoplasmic polyadenylation element binding protein (CPEB) homologue Orb2 is a functional amyloid that plays a key regulatory role for long-term memory in Drosophila. Orb2 has a glutamine, histidine-rich (Q/H-rich) domain that resembles the Q/H-rich, metal binding domain of the Hpn-like protein (Hpnl) found in Helicobacter pylori. In the present study, we used chromatography and isothermal titration calorimetry (ITC) to show that the Q/H-rich domain of Orb2 binds Ni2+ and other transition metals ions with μM affinity. Using site directed mutagenesis, we show that several histidine residues are important for binding. In particular, the H61Y mutation, which was previously shown to affect the aggregation of Orb2 in cell culture, completely inhibited metal binding of Orb2. Finally, we used thioflavin T fluorescence and electron microscopy images to show that Ni2+ binding induces the aggregating of Orb2 into structures that are distinct from the amyloid fibrils formed in the absence of Ni2+. These data suggest that transition metal binding might be important for the function of Orb2 and potentially long-term memory in Drosophila

Lipid concentration and molar ratio boundaries for the use of isotropic bicelles

Bicelles are model membranes generally made of long-chain dimyristoylphosphatidylcholine (DMPC) and short-chain dihexanoyl-PC (DHPC). They are extensively used in the study of membrane interactions and structure determination of membrane-associated peptides, since their composition and morphology mimic the widespread PC-rich natural eukaryotic membranes. At low DMPC/DHPC (q) molar ratios, fast-tumbling bicelles are formed in which the DMPC bilayer is stabilized by DHPC molecules in the high-curvature rim region. Experimental constraints imposed by techniques such as circular dichroism, dynamic light scattering, or microscopy may require the use of bicelles at high dilutions. Studies have shown that such conditions induce the formation of small aggregates and alter the lipid-to-detergent ratio of the bicelle assemblies. The objectives of this work were to determine the exact composition of those DMPC/DHPC isotropic bicelles and study the lipid miscibility. This was done using 31P nuclear magnetic resonance (NMR) and exploring a wide range of lipid concentrations (2–400 mM) and q ratios (0.15–2). Our data demonstrate how dilution modifies the actual DMPC/DHPC molar ratio in the bicelles. Care must be taken for samples with a total lipid concentration ?250 mM and especially at q 1.5–2, since moderate dilutions could lead to the formation of large and slow-tumbling lipid structures that could hinder the use of solution NMR methods, circular dichroism or dynamic light scattering studies. Our results, supported by infrared spectroscopy and molecular dynamics simulations, also show that phospholipids in bicelles are largely segregated only when q > 1. Boundaries are presented within which control of the bicelles’ q ratio is possible. This work, thus, intends to guide the choice of q ratio and total phospholipid concentration when using isotropic bicelles