Novel prognostic factors in chronic myeloid leukemia

Chronic myeloid leukemia (CML) is a malignant clonal blood disease that originates from a pluripotent hematopoietic stem cell. The cytogenetic hallmark of CML, the Philadelphia chromosome (Ph), is formed as a result of reciprocal translocation between chromosomes 9 and 22, which leads to a formation of a chimeric BCR-ABL fusion gene. The BCR-ABL protein is a constitutively active tyrosine kinase that changes the adhesion properties of cells, constitutively activates mitogenic signaling, enhances cell proliferation and reduces apoptosis. This results in leukemic growth and the clinical disease, CML. With the advent of targeted therapies against the BCR-ABL fusion protein, the treatment of CML has changed considerably during the recent decade. In this thesis, the clinical significance of different diagnostic methods and new prognostic factors in CML have been assessed. First, the association between two different methods for measuring CML disease burden (the RQ-PCR and the high mitotic index metaphase FISH) was assessed in bone marrow and peripheral blood samples. The correlation between positive RQ-PCR and metaphase FISH samples was high. However, RQ-PCR was more sensitive and yielded measurable transcripts in 40% of the samples that were negative by metaphase FISH. The study established a laboratory-specific conversion factor for setting up the International Scale when standardizing RQ-PCR measurements. Secondly, the amount of minimal residual disease (MRD) after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (alloHSCT) was determined. For this, metaphase FISH was done for the bone marrow samples of 102 CML patients. Most (68%), had no residual cells during the entire follow-up time. Some (12 %) patients had minor (<1%) MRD which decreased even further with time, whereas 19% had a progressive rise in MRD that exceeded 1% or had more than 1% residual cells when first detected. Residual cells did not become eradicated spontaneously if the frequency of Ph+ cells exceeded 1% during follow-up. Next, the impact of deletions in the derivative chromosome 9, was examined. Deletions were observed in 15% of the CML patients who later received alloHSCT. After alloHSCT, there was no difference in the total relapse rate in patients with or without deletions. Nor did the estimates of overall survival, transplant-related mortality, leukemia-free survival and relapse-free time show any difference between these groups. When conventional treatment regimens are used, the der(9) status could be an important criterion, in conjunction with other prognostic factors, when allogeneic transplantation is considered. The significance of der(9) deletions for patients treated with tyrosine kinase inhibitors is not clear and requires further investigation. In addition to the der(9) status of the patient, the significance of bone marrow lymphocytosis as a prognostic factor in CML was assessed. Bone marrow lymphocytosis during imatinib therapy was a positive predictive factor and heralded optimal response. When combined with major cytogenetic response at three months of treatment, bone marrow lymphocytosis predicted a prognostically important major molecular response at 18 months of imatinib treatment. Although the validation of these findings is warranted, the determination of the bone marrow lymphocyte count could be included in the evaluation of early response to imatinib treatment already now. Finally, BCR-ABL kinase domain mutations were studied in CML patients resistant against imatinib treatment. Point mutations detected in the kinase domain were the same as previously reported, but other sequence variants, e.g. deletions or exon splicing, were also found. The clinical significance of the other variations remains to be determined.Krooninen myelooinen leukemia (KML) on pahanlaatuinen veren kantasolujen sairaus, jolle on tyypillistä luuytimen lisääntynyt granulosyyttisarjan valkosolujen tuotanto. KML:n tunnusmerkki on fuusiogeeni BCR-ABL, joka on muodostunut kromosomien 9 ja 22 välisen translokaation eli siirtymän seurauksena (Philadelphia-kromosomi). BCR-ABL-onkogeeni tuottaa jatkuvasti aktiivisessa muodossa olevaa tyrosiinikinaasientsyymiä, joka aktivoi useita solusignaalivälitysteitä ja johtaa poikkeavuuksiin solusyklin, adheesion ja apoptoosin säätelyssä. KML:n molekyylitason patogeneesi on hyvin tunnettu ja sen seurauksena on kehitetty ensimmäinen syövän täsmähoito, imatinibi. Lähes kaikkien uusien potilaiden hoito aloitetaan imatinibillä, ja yksin tällä lääkityksellä n. 75% potilaista saa täyden sytogeneettisen vasteen 12-18 kuukauden kuluessa. Herkillä seurantamenetelmillä voidaan kuitenkin lähes kaikilla potilailla todeta leukeemisia jäännössoluja. Allogeeninen kantasolujensiirto on KML:n parantava hoito, johon kuitenkin liittyy 20 %:n kuolleisuus. Viime vuosien keskeinen kysymys KML:n hoidossa onkin ollut hoidon valinta: milloin tulee edetä välittömästi kantasolujensiirtoon ja milloin voidaan tautia seurata ainoastaan imatinibihoidolla. Hyviä kriteereitä ei ole, koska KML:n hoitovastetta ja taudinkulkua ei tällä hetkellä voida ennustaa. Tämän väitöskirjatyön tarkoituksena oli tutkia geeni- ym. muutoksia, jotka mahdollisimman varhain ennustaisivat taudin kulkua ja vastetta sekä lääkehoitoon, että kantasolujensiirtoon. Sytomolekyyligeneettisiä (ns. metafaasi-FISH -menetelmä) ja molekyyligeneettisiä (ns. RQ-PCR-tekniikka) seurantamenetelmiä vertailevassa tutkimuksessa arvioitiin näiden menetelmien herkkyyttä ja keskinäistä yhteneväisyyttä havaita leukeemisia jäännössoluja luuydin- ja verinäytteistä. Eri menetelmillä saatujen tulosten välinen korrelaatio oli hyvä. Erityisesti luuydinnäytteistä tehtyjen FISH- ja RQ-PCR-tutkimusten sekä veri- ja luuydinnäytteistä tehtyjen RQ-PCR-tutkimusten tulokset korreloivat hyvin toisiinsa. RQ-PCR-tutkimukset olivat kuitenkin FISH-tutkimuksia herkempiä vähäisen jäännöstaudin osoittamisessa. Tämän päivän RQ-PCR-tutkimusten tavoitteena on standardisoida menetelmät siten, että eri laboratorioissa tuotetut RQ-PCR-tutkimustulokset olisivat kansainvälisesti keskenään vertailtavissa ns. kansainvälisellä asteikolla (International Scale, IS). Työssä esitettiin lisäksi malli muuntaa laboratoriossa saatavat RQ-PCR-tulokset tälle asteikolle. Allogeenisen kantasolujensiirron jälkeen todettavien leukeemisten Philadelphia-kromosomipositiivisten jäännössolujen merkitystä KML-potilaan ennusteelle tutkittiin yli sadan potilaan aineistossa. Tutkimuksessa todettiin, että poikkeavien jäännössolujen osuuden nouseva suuntaus tai yhden prosentin määrä jäännössoluja oli tässä potilasaineistossa raja, jota suuremmat solumäärät eivät hävinneet potilaan luuytimestä ilman poikkeavat solut eivät hävinneet ilman hoitotoimenpiteitä. Tutkimustuloksia voidaan hyödyntää kliinisissä toimenpiteissä. Osalla KML-potilaista Philadelphia-translokaation syntymähetkellä kromosomi 9:stä häviää alue, joka sisältämillä geeneillä on todennäköisesti tärkeä merkitys taudin patogeneesissä. (der 9 deleetio). Deleetion omaavien potilaiden tauti etenee nopeasti ja vastaa huonosti perinteiseen lääkehoitoon. Der 9 deleetion vaikutusta KML-potilaiden taudinkulkuun ja hoitovasteeseen allogeenisen kantasolujensiirron jälkeen tutkittiin yli sadan KML-potilaan aineistossa, jossa 15%:lla tutkituista todettiin kyseinen deleetio. Kantasolujensiirron jälkeen taudin uusiutumisessa ei todettu eroa potilaiden, joilla oli todettu deleetio, tai potilaiden, joilla deleetiota ei todettu, välillä. Myöskään kokonaiselossaoloajassa, kantasolujensiirtoon liittyvässä kuolleisuudessa tai leukemia-vapaassa elinajassa ei todettu eroja näiden ryhmien välillä. Perinteisiä hoitomuotoja käytettäessä der 9 deleetiota voitaisiin muiden ennustetekijöiden ohella pitää yhtenä tekijänä kantasolujensiirtoa harkittaessa. Tyrosiinikinaasin estäjälääkitystä käytettäessä deleetion merkitys ei kuitenkaan toistaiseksi ole selvillä, mikä antaa aihetta lisätutkimuksille. Imatinibilääkityksellä hoidettavien potilaiden luuydinnäytteissä todetaan toisinaan lymfosyyttiylimäärää, jonka ennusteellista merkitystä potilaan hoitovasteeseen arvioitiin neljännessä osatyössä. Luuytimen lymfosytoosin todettiin olevan uusi, vahva ennustetekijä yhdessä sytogeneettisen vasteen kanssa imatinibihoidon optimaalisen molekyylitason vasteen suhteen. Heikon 12 kuukauden hoitovasteen saaneet potilaat voitiin todeta jo kolmen kuukauden seurantanäytteen yhteydessä lymfosytoosin puuttuessa. Luuytimen lymfosyyttien määritystä voitaisiinkin pitää yhtenä imatinibihoidon alkuvaiheen vastemittarina. Osa imatinibilla hoidetuista potilaista menettää hoitovasteen ajan kuluessa, eli potilaille kehittyy imatinibiresistenssi. Tämä johtuu useimmiten BCR-ABL-geenin mutaatioista, joista osaa voidaan estää suuremmalla imatinibiannoksella, osa taas vaatii kokonaan uuden lääkkeen. Mutaatioiden tunnistaminen onkin merkittävää potilaan hoidon kannalta. Väitöskirjan viides osatyö kartoitti imatinibiresistenssiin liittyviä mutaatioita sekä suomalaisessa että norjalaisessa potilasaineistossa. Tutkimuksessa todetut pistemutaatiot olivat tunnettuja imatinibiresistenssin aiheuttavia muutoksia. Näiden lisäksi aineistossa todettiin muita DNA-muutoksia, kuten häviämiä tai eksonien silmukoitumista. Näiden löydösten kliininen merkitys on kuitenkin avoin ja vaatii jatkotutkimuksia. Työ on tuottanut uuden tutkimustiedon lisäksi diagnostisessa käytössä olevan menetelmän, joka voidaan tehdä potilasnäytteistä lääkeresistenssiä epäiltäessä

Abnormal expression of apoptosis-related genes in haematological malignancies: Overexpression of MYC is poor prognostic sign in mantle cell lymphoma

The expression of apoptosis-related genes BCL2, BAX, BCL2L1, BCL2A1, MCL1, DAPK1 and MYC was studied by quantitative real-time polymerase chain reaction on total RNA samples from patients with acute lymphoblastic leukaemia (ALL, n = 16), acute myeloid leukaemia (AML, n = 27). chronic myeloid leukaemia (CML, n = 12), mantle cell lymphoma (MCL, n = 19) and chronic lymphoid leukaemia (CLL. n = 32). BCL2, BAX, BCL2A1, MCL1, DAPK1 and MYC were overexpressed in all patient groups. BCL2L1 was underexpressed in CLL and CML, but not in AML, ALL and MCL. MCL1 levels were significantly higher in CD13 and CD33-positive ALL, and in CD56-positive AML samples. BCL2, BCL2L1, BCL2A1 and MCL1 were overexpressed and DAPK1 was underexpressed in CLL samples with a 11q23 deletion. MYC overexpression was significantly associated with shorter overall survival in MCL (P ≤ 0.01). AML patients with a normal karyotype showed a higher frequency of BCL2A1 overexpression (P ≤ 0.001) than those with an abnormal karyotype.Facultad de Ciencias Naturales y Muse

Abnormal expression of apoptosis-related genes in haematological malignancies: Overexpression of MYC is poor prognostic sign in mantle cell lymphoma

The expression of apoptosis-related genes BCL2, BAX, BCL2L1, BCL2A1, MCL1, DAPK1 and MYC was studied by quantitative real-time polymerase chain reaction on total RNA samples from patients with acute lymphoblastic leukaemia (ALL, n = 16), acute myeloid leukaemia (AML, n = 27). chronic myeloid leukaemia (CML, n = 12), mantle cell lymphoma (MCL, n = 19) and chronic lymphoid leukaemia (CLL. n = 32). BCL2, BAX, BCL2A1, MCL1, DAPK1 and MYC were overexpressed in all patient groups. BCL2L1 was underexpressed in CLL and CML, but not in AML, ALL and MCL. MCL1 levels were significantly higher in CD13 and CD33-positive ALL, and in CD56-positive AML samples. BCL2, BCL2L1, BCL2A1 and MCL1 were overexpressed and DAPK1 was underexpressed in CLL samples with a 11q23 deletion. MYC overexpression was significantly associated with shorter overall survival in MCL (P ≤ 0.01). AML patients with a normal karyotype showed a higher frequency of BCL2A1 overexpression (P ≤ 0.001) than those with an abnormal karyotype.Facultad de Ciencias Naturales y Muse

RAD50 and NBS1 are breast cancer susceptibility genes associated with genomic instability.

To access publisher full text version of this article. Please click on the hyperlink in Additional Links fieldThe Mre11 complex, composed of RAD50, NBS1 and MRE11, has an essential role in the maintenance of genomic integrity and preventing cells from malignancy. Here we report the association of three Mre11 complex mutations with hereditary breast cancer susceptibility, studied by using a case-control design with 317 consecutive, newly diagnosed Northern Finnish breast cancer patients and 1000 geographically matched healthy controls (P = 0.0004). RAD50 687delT displayed significantly elevated frequency in the studied patients (8 out of 317, OR 4.3, 95% CI 1.5-12.5, P= 0.008), which indicates that it is a relatively common low-penetrance risk allele in this cohort. Haplotype analysis and the screening of altogether 512 additional breast cancer cases from Sweden, Norway and Iceland suggest that RAD50 687delT is a Finnish founder mutation, not present in the other Nordic cohorts. The RAD50 IVS3-1G>A splicing mutation leading to translational frameshift was observed in one patient, and the NBS1 Leu150Phe missense mutation affecting a conserved residue in the functionally important BRCA1 carboxy-terminal (BRCT) domain in two patients, both being absent from 1000 controls. Microsatellite marker analysis showed that loss of the wild-type allele was not involved in the tumorigenesis in any of the studied mutation carriers, but they all showed increased genomic instability assessed by cytogenetic analysis of peripheral blood T-lymphocytes (P = 0.006). In particular, the total number of chromosomal rearrangements was significantly increased (P = 0.002). These findings suggest an effect for RAD50 and NBS1 haploinsufficiency on genomic integrity and susceptibility to cancer

The KMT2A recombinome of acute leukemias in 2023

Chromosomal rearrangements of the human KMT2A/MLL gene are associated with de novo as well as therapy-induced infant, pediatric, and adult acute leukemias. Here, we present the data obtained from 3401 acute leukemia patients that have been analyzed between 2003 and 2022. Genomic breakpoints within the KMT2A gene and the involved translocation partner genes (TPGs) and KMT2A-partial tandem duplications (PTDs) were determined. Including the published data from the literature, a total of 107 in-frame KMT2A gene fusions have been identified so far. Further 16 rearrangements were out-of-frame fusions, 18 patients had no partner gene fused to 5'-KMT2A, two patients had a 5'-KMT2A deletion, and one ETV6::RUNX1 patient had an KMT2A insertion at the breakpoint. The seven most frequent TPGs and PTDs account for more than 90% of all recombinations of the KMT2A, 37 occur recurrently and 63 were identified so far only once. This study provides a comprehensive analysis of the KMT2A recombinome in acute leukemia patients. Besides the scientific gain of information, genomic breakpoint sequences of these patients were used to monitor minimal residual disease (MRD). Thus, this work may be directly translated from the bench to the bedside of patients and meet the clinical needs to improve patient survival