Determination of the mechanism of action of diazepinones targeting melanoma

Le mélanome est la forme de cancer de la peau la plus meurtrière. Cette agressivité est due à sa forte tendance à métastaser, entraînant un mauvais pronostic. Malgré l’introduction en 2011 de stratégies thérapeutiques innovantes (inhibiteurs de kinases et immunothérapies), les patients font toujours face à des résistances innées ou acquises et ces nouveaux traitements n’offrent qu’une amélioration partielle et temporaire. En raison d'une incidence globale dans le monde en perpétuelle augmentation, le développement de nouveaux médicaments et de nouvelles combinaisons thérapeutiques agissant contre le mélanome métastatique (MM) est un défi de santé publique majeur.Le JMV5038, une pyrido-imidazo[1,3]diazépinone produite par l’équipe, avait montré lors d’un criblage sur le panel de 60 lignées cellulaires cancéreuses du National Cancer Institute, une activité particulièrement intéressante (GI50 de l’ordre du micromolaire) sur plusieurs lignées. Ces résultats ont été confirmés au sein de notre institut sur plusieurs lignées de mélanome malin humain (MDA-MB-43, A375). L’objectif de cette thèse était de préciser, par des études in vitro utilisant comme modèles cellulaires 3 lignées humaines de mélanome malin (A375, MDA-MB-435, B16F10), le mécanisme d’action (MOA) du JMV5038. Notre stratégie expérimentale s’articulait autour de trois objectifs : (a) déterminer la localisation intracellulaire du JMV5038, (b) développer des outils afin d'identifier sa ou ses cibles pharmacologiques et (c) préciser son mécanisme d’action moléculaire. L’imagerie Raman s’est avérée la technique la plus adaptée pour déterminer la localisation/distribution du JMV5038, une petite molécule active et non intrinsèquement fluorescente. Une accumulation du JMV5038 au niveau de l’espace péri-membranaire des cellules de mélanome a ainsi pu être mise en évidence. Nous avons développé à partir du JMV5038 des pré-sondes qui permettront d’identifier la ou les cibles pharmacologiques du JMV5038 in cellulo, par une approche de protéomique-chimique basée sur la chimie-click. Ce développement chimique nous a aussi donné des informations précieuses quant aux relations structure activité (RSA) des diazépinones. Enfin, les études fonctionnelles nous ont permis de progresser significativement dans la compréhension du MOA du JMV5038. En effet, nous avons montré que l’activité antitumorale du JMV5038 est associée à une inhibition indirecte et atypique de la protéine Chk1, classiquement impliquée dans la voie de réponses aux dommages à l’ADN. Cette inhibition est due à une augmentation de la phosphorylation en S280 de Chk1, entraînant une modification de sa localisation (accumulation cytoplasmique) et donc potentiellement une inhibition de son activité. Ce défaut dans l’axe ATR/Chk1 entraine alors une sensibilisation des cellules cancéreuses au stress réplicatif, caractérisée par une catastrophe mitotique et la mort cellulaire par apoptose. Pour finir, nous avons montré que l’apoptose induite par le JMV5038 entrainait le relargage de signaux pouvant déclencher une réponse immunitaire. Le JMV5038 serait donc un candidat original et pertinent pour développer une nouvelle famille d’agents à utiliser, soit en association avec des chimiothérapies classiques induisant un stress réplicatif, soit en association avec des immunothérapies récentes, afin de stimuler et potentialiser leur activité thérapeutique anticancéreuse.Melanoma is the deadliest form of skin cancer. This aggressiveness is due to a strong tendency to metastasize, resulting in a poor prognosis. Despite the introduction in 2011 of innovative therapeutic strategies (kinase inhibitors and immunotherapies), patients still face innate or acquired resistance and these new treatments offer only partial and temporary improvement. Due to an ever increasing global incidence, the development of new drugs and new therapeutic combinations acting against metastatic melanoma (MM) is a major public health challenge.JMV5038, a pyrido-imidazo [1,3] diazepinone produced by the team, had shown during a screening on the 60 cancer cell lines panel of the National Cancer Institute, a particularly interesting activity (GI50 of the order micromolar) on several lines. These results have been confirmed within our institute on several human malignant melanoma lines (MDA-MB-43, A375). The objective of this thesis was to clarify, by in vitro studies using as cell models 3 human lines of malignant melanoma (A375, MDA-MB-435, B16F10), the mechanism of action (MOA) of JMV5038. Our experimental strategy revolved around three objectives: (a) determining the intracellular localization of JMV5038, (b) developing tools to identify its pharmacological target(s) and (c) clarifying its molecular action mechanism. Raman imaging has proven to be the most suitable technique for determining the location/distribution of JMV5038, a small active molecule which is not intrinsically fluorescent. An accumulation of JMV5038 in the peri-membrane space of melanoma cells was thus demonstrated. From JMV5038, we developed pre-probes that will allow the identification of the pharmacological targets of JMV5038 in cellulo, by a chemical proteomic approach based on click-chemistry. This chemical development has also given us valuable information on the structure activity relationships (SAR) of diazepinones. Finally, functional studies have allowed us to make significant progress in the understanding of the MOA of JMV5038. Indeed, we have shown that the anti-tumor activity of JMV5038 is associated with an indirect and atypical inhibition of the Chk1 protein, involved in the DNA-damage responses pathway. This inhibition is due to an increase of the S280 phosphorylation of Chk1, leading to a modification of its location (cytoplasmic accumulation) and therefore potentially an inhibition of its activity. This defect in the ATR/Chk1 axis then leads to sensitization of cancer cells to replicative stress, characterized by a mitotic catastrophe and cell death by apoptosis. Finally, we have shown that apoptosis induced by JMV5038 leads to the release of signals that can trigger an immune response. JMV5038 would therefore be an original and relevant candidate to develop a new family of agents to be used, either in combination with conventional chemotherapies inducing replicative stress, or in association with recent immunotherapies, in order to stimulate and potentiate their anti-cancer therapeutic activity

Imidazopyridine-fused [1,3]diazepinones: modulations of positions 2 to 4 and their impacts on the anti-melanoma activity

A series of 19 novel pyrido-imidazodiazepinones, with modulations of positions 2, 3 and 4 of the diazepine ring were synthesised and screened for their in vitro cytotoxic activities against two melanoma cell lines (A375 and MDA-MB-435) and for their potential toxicity against NIH-3T3 non-cancerous cells. Selected compounds were also evaluated on the NCI-60 cell line panel. The SAR study revealed that the molecular volume and the cLogP of compounds modified at position 2 were significantly correlated with the activity of these compounds on melanoma cell lines. Moreover, introduction of a heterocyclic group at position 2 or an azido-alkyl chain at position 4 led to compounds displaying a significantly different activity profile on the NCI-60 cell line panel, compared to phenyl-substituted compounds at position 2 of the diazepinone. This study provides us crucial information for the development of new derivatives active against melanoma

RNA testing for the diagnosis of acute hepatitis A during the 2017 outbreak in France

International audienc