Discovery and Differential Processing of HLA Class II-Restricted Minor Histocompatibility Antigen LB-PIP4K2A-1S and Its Allelic Variant by Asparagine Endopeptidase

Minor histocompatibility antigens are the main targets of donor-derived T-cells after allogeneic stem cell transplantation. Identification of these antigens and understanding their biology are a key requisite for more insight into how graft vs. leukemia effect and graft vs. host disease could be separated. We here identified four new HLA class II-restricted minor histocompatibility antigens using whole genome association scanning. For one of the new antigens, i.e., LB-PIP4K2A-1S, we measured strong T-cell recognition of the donor variant PIP4K2A-1N when pulsed as exogenous peptide, while the endogenously expressed variant in donor EBV-B cells was not recognized. We showed that lack of T-cell recognition was caused by intracellular cleavage by a protease named asparagine endopeptidase (AEP). Furthermore, microarray gene expression analysis showed that PIP4K2A and AEP are both ubiquitously expressed in a wide variety of healthy tissues, but that expression levels of AEP were lower in primary acute myeloid leukemia (AML). In line with that, we confirmed low activity of AEP in AML cells and demonstrated that HLA-DRB1*03:01 positive primary AML expressing LB-PIP4K2A-1S or its donor variant PIP4K2A-1N were both recognized by specific T-cells. In conclusion, LB-PIP4K2A-1S not only represents a novel minor histocompatibility antigen but also provides evidence that donor T-cells after allogeneic stem cell transplantation can target the autologous allelic variant as leukemia-associated antigen. Furthermore, it demonstrates that endopeptidases can play a role in cell type-specific intracellular processing and presentation of HLA class II-restricted antigens, which may be explored in future immunotherapy of AML

Hsc70 Reguliert Den Interzellulären Transfer Des Y-Chromosom Antigens DBY via Mikrovesikel

Recent studies have demonstrated that CD4 T lymphocytes (T cells) can efficiently reject major histocompatibility complex (MHC) class II-negative tumors in vivo. This requires presentation of tumor-associated antigens on surrounding antigen-presenting cells, but the mechanism of intercellular antigen transfer is poorly understood. We hypothesized that intercellular transfer of proteins is not the sole consequence of cell death-mediated protein release but requires an active transfer which depends on KFERQ-like binding motifs on target proteins and the process of microautophagy. To prove this, we used the human Y-chromosome antigen DBY as a model-antigen and identified two putative KFERQ-like motifs. We found that mutation of the first KFERQ-like motif significantly impaired indirect T cell recognition. Moreover, indirect recognition was completely abolished when the peptide was truncated and only encoded the DBY epitope, indicating additional regulatory elements located outside of the T cell epitope are required. Also, we provide evidence that indirect presentation of DBY relies on protein-protein interaction between DBY and heat shock cognate protein 70 and that intercellular transfer is mediated via CD63-positive exosomes. Our data indicate that indirect recognition of tumor-associated antigens on surrounding antigen-presenting cells requires an active process of antigen transfer. Furthermore, by screening a random mutagenesis library, we obtained preliminary data that an additional protein-site in DBY might be important for the selective antigen transfer. Finally, to demonstrate the in vivo relevance of this mechanism, a mouse model of MHC class II-negative tumor rejection was successfully established.Aktuelle Forschungen haben gezeigt, dass CD4 T-Lymphozyten (T-Zellen) Major-Histokompatibilitätskomplex (MHC) Klasse II-negative Tumore in vivo effizient abstoßen können. Dieses Ereignis setzt jedoch die Präsentation von tumor-assoziierten Antigenen auf umliegenden Antigen-präsentierenden Zellen (APZ) voraus, wobei der Mechanismus des interzellulären Antigentransfers weitestgehend unverstanden ist. Möglichkeiten der unkontrollierten Antigenfreisetzung sind beispielsweise durch nekrotische Zellen aber auch nach externen Eingriffen, wie durch Strahlentherapien, gegeben. Im Gegensatz dazu bildet die zellvermittelte Absonderung membranumhüllter Vesikel eine Quelle kontrollierter Antigenfreisetzung. Insbesondere Exosomen gelten dabei als wichtige, interzelluläre Kommunikationsvehikel von denen bekannt ist, dass sie Nukleinsäuren, Lipide und Proteine transportieren. Erst kürzlich wurde beschrieben, dass zytosolische Proteine durch das artverwandte Hitzeschockprotein 70 (hsc70) zu intraluminalen Vesikeln des späten Endosoms transportiert werden können. Mechanistisch geschieht dies durch einen mikroautophagie-ähnlichen Signalweg, bei dem die Erkennung sogenannter KFERQ-like Signalmotive auf Zielproteinen von entscheidender Bedeutung ist. Die vorliegende Arbeit hat den Fokus, den Mechanismus des interzellulären Antigentransfers zu charakterisieren. Dabei wurde die Hypothese aufgestellt, dass dem interzellulären Antigentransfer ein aktiver Transport zugrunde liegt, welcher mechanistisch durch hsc70 und in mikroautophagie-ähnlicher Art und Weise vermittelt wird. Um dieser Annahme nachzugehen, wurden zunächst Tumorzelllinien generiert, die mit dem vollständigen humanen Y-Chromosom Antigen DBY, dessen X-Chromosom Homolog DBX, dem CD4 T-Zellepitop von DBY (Polypeptid, DBY 25-mer) und dem vollständigem DBY mit Mutationen (in jeweils einer oder beiden putativen hsc70 Bindungsstellen) transduziert wurden. Nach interzellulärem Transfer konnte eine T-Zellaktivierung für das vollständige DBY und für eine der beiden Einzelmutanten gemessen werden. Hingegen war die T-Zellerkennung der anderen Einzelmutante und der Doppelmutante signifikant reduziert, sowie im Falle des DBY 25-mers sogar vollständig abwesend. Weitere Untersuchungen, die mit Hilfe eines Immunassays durchgeführt wurden, ergaben, dass die Protein-Protein Interaktion zwischen hsc70 und der sensitiven DBY Einzelmutante deutlich reduziert war, während keine Interaktion mit dem kurzen DBY 25-mer beobachtet wurde. Diese Daten unterstützen die Hypothese, dass der interzelluläre Antigentransfer spezifisch reguliert werden kann, wobei hsc70, wie initial vermutet, eine wichtige Rolle zu spielen scheint. Da es nach Übertragung von Kulturüberständen transgenpositiver HeLa-Zellen auf Antigennegative APZ zur T-Zellaktivierung kam, konnte gezeigt werden, dass es sich um einen zellkontaktunabhängigen Transfer des Antigens handelte. Darüber hinaus zeigte eine elektronenmikroskopische Untersuchung der transduzierten Zellen eine Assoziation von DBY mit dem exosomen-assoziierten Tetraspanin-30 (CD63). Um dies im Detail zu analysieren, wurden Exosomen aus Zellkulturüberständen transgenpositiver HeLa-Zellen mittels differentieller Ultrazentrifugation aufgereinigt und auf antigennegative APZ übertragen, um anschließend die T-Zellerkennung zu untersuchen. Dabei fiel auf, dass das vollständige DBY den T-Zellklon aktivieren konnte, während die sensitive DBY Mutante eine deutlich reduzierte T-Zellerkennung aufwies und das DBY 25-mer wiederum nicht zur T-Zellaktivierung führte. Außerdem konnte das vollständige DBY in isolierten CD63-positiven Exosomen auf Proteinebene nachgewiesen werden. Diese Daten zeigen, dass die indirekte Erkennung von tumor-assoziierten Antigenen auf umliegenden APZ das Ergebnis eines aktiven Antigentransfers via sezernierte Mikrovesikel sein kann. Da die Mutation der putativen hsc70 Bindungsstellen jedoch nur zu einer Reduktion des interzellulären Transfers und nicht zu einer vollständigen Blockade führten, wurden Klonbibliotheken mit mutierten DBY Konstrukten zur Identifikation weiterer regulatorischer Elemente generiert. Interessanterweise wiesen die Daten darauf hin, dass der selektive Antigentransfer von DBY durch eine weitere Stelle in der Proteinsequenz reguliert sein könnte. Um diesbezüglich genauere Aussagen treffen zu können, werden künftig weitere Untersuchungen durchgeführt. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die Bindung von hsc70 an putative KFERQ-like Motive in der Proteinsequenz des humanen DBY mit dem interzellulären Transfer korreliert. Die in dieser Forschungsarbeit erhobenen Daten weisen außerdem darauf hin, dass die interzelluläre Übertragung von DBY spezifisch durch sekretierte, CD63-positive Exosomen erfolgt. Diese Ergebnisse stellen hsc70 als möglichen Regulator für den interzellulären Antigentransfer bestimmter zytosolischer Proteine dar. Um die in vivo Relevanz des hier beschriebenen Mechanismus beantworten zu können, wurde im abschließenden Teil dieser Arbeit ein Mausmodell zur Untersuchung der Abstoßung von MHC Klasse II-negativen Tumoren etabliert. Künftige Forschungsarbeiten werden sich daher mit der in vivo Immunantwort beschäftigen, um den Einfluss der Bindung von hsc70 an tumor-assoziierte Antigene bei der Eradikation von MHC Klasse II-negativen Tumoren beurteilen zu können

Thermographische Erfassung der Oberflächentemperatur im Kopfbereich von Kälbern unter Stallbedingungen

Thermographic examination of 157 German Holstein heifer calves was performed to investigate the feasibility of this technique for on-farm recording of surface temperature of the head and to examine potential factors that affect the recordings. Baseline values were obtained from six defined locations on the head including both eyes, both horn buds, the muzzle and the mucous membrane of the muzzle using a high-end thermographic camera (ThermoPro TP8, Firma DIAS Infrared GmbH). Evaluation of the influence of various factors on thermographic measurements showed that ambient temperature had the largest effect on surface temperature of the head (regression coefficient, 0.10 to 0.32, p ≤ 0.01) whereas humidity had no effect (in t-test p ≥ 0.33 over all locations). There was a no correlation between rectal temperature and surface temperature (rp ≤ 0.05). The surface temperature decreased with increasing age of the calves (regression coefficient, - 0.42 to – 0.14, p ≤ 0.01). The agreement between double readings made shortly after one another was excellent at all locations (r ≥ 0.95). The emission of infrared energy varied among different locations; the most infrared energy was emitted by the eyes and the least by the muzzle. Paired locations (eyes and horn buds) had symmetric emission patterns of infrared energy. Measuring the surface temperature of the head of calves in their normal barn environment using a standardised protocol was feasible and thus could potentially be used for monitoring calves under field conditions

Einsatz der Thermographie zum Monitoring der operationsbedingten Hitzeentwicklung während der thermischen Enthornung von Kälbern

The goal of this study was to determine the skin surface temperatures of the head using thermography in 28 German Holstein heifer calves at the time of hot iron disbudding. Calves were divided into group 1 (hot-iron disbudding, n = 14) and 2 (sham disbudding, n = 14). Thermographic measurements were made at eight locations of the head (area surrounding both horn buds, both horn buds, muzzle, mucous membranes of the muzzle, both eyes) at nine time points (- 60 min (basal value), time of disbudding, 5, 30, 60, 90, 120, 240 and 480 min after disbudding) using a high-end thermographic camera (ThermoPro TP8, Firma DIAS Infrared GmbH). The rectal temperature was measured 60 min before and 5, 240 and 480 min after disbudding. The statistical software SAS version 9.4 was used for analysis. Skin surface temperatures and rectal temperature correlated at several locations (rp ≥ 0.45; p ≤ 0.05). The maximum temperature (approx. 67 ºC) was measured at the horn buds immediately after the hot-iron procedure. By five and 30 min after hot-iron disbudding, the temperature of the horn buds had decreased by up to 50%, whereas the temperatures at the other locations had increased significantly (p < 0.01) in both groups compared with the basal values. Measurements at 60, 90 and 120 min after the procedure both groups showed a continuous temperature increase (vicinity of both horn buds, both eyes and at the muzzle and associated mucous membranes) or a temperature plateau (both horn buds). The temperature returned to basal values at all locations (excl. muzzle and associated mucous membranes) between 4 and 8 hours after the procedure. The similarities between the temperature patterns observed in the present study and published blood cortisol concentrations in calves undergoing hot iron disbudding suggest that temperature increases reflect a perioperative stress response. Further studies are necessary to evaluate whether thermography of the head could serve as a proxy for the non-invasive evaluation of pain and stress in calves

Chaperone protein HSC70 regulates intercellular transfer of Y chromosome antigen DBY.

Recent studies have demonstrated that CD4+ T cells can efficiently reject MHC-II-negative tumors. This requires indirect presentation of tumor-associated antigens on surrounding antigen-presenting cells. We hypothesized that intercellular transfer of proteins is not the sole consequence of cell death-mediated protein release, but depends on heat-shock cognate protein 70 (HSC70) and its KFERQ-like binding motif on substrate proteins. Using human Y chromosome antigen DBY, we showed that mutation of one of its 2 putative binding motifs markedly diminished T cell activation after indirect presentation and reduced protein-protein interaction with HSC70. Intercellular antigen transfer was shown to be independent of cell-cell contact, but relied on engulfment within secreted microvesicles. In vivo, alterations of the homologous KFERQ-like motif in murine DBY hampered tumor rejection, T cell activation, and migration into the tumor and substantially impaired survival. Collectively, we show that intercellular antigen transfer of DBY is tightly regulated via binding to HSC70 and that this mechanism influences recognition and rejection of MHC-II-negative tumors in vivo