Potential use of temporin derivatives against infections caused by the herpes simplex virus type 1 (HSV-1, Herpes Simplex Virus 1)

Peptydy przeciwdrobnoustrojowe posiadają szereg aktywności, wśród których oprócz zdolności bójczych, możemy wyróżnić m. in. właściwości immunomodulujące, a także przeciwnowotworowe. Dowolność łączenia ze sobą peptydów posiadających szerokie spektrum właściwości leczniczych, przy jednoczesnym braku cytotoksyczności względem komórek eukariotycznych, daje możliwość tworzenia nowych, bardziej specyficznych i bezpiecznych leków. Przedmiotem badań niniejszej pracy było zbadanie wpływu trzech koniugatów peptydowych (DAL-PEG-DK5, DAL-PEG-KSLW oraz DAL-PEG-LK6) na zakażenia wywołane przez wirusa opryszczki pospolitej typu pierwszego (HSV-1, ang. Herpes Simplex Virus 1). Badane koniugaty są połączeniem syntetycznego analogu enkefaliny (DAL), peptydu wykazującego właściwości pro-proliferacyjne, redukujące stres oksydacyjny oraz ból, z syntetycznymi peptydami o działaniu przeciwdrobnoustrojowym: DK5, KSLW, LK6. Peptydy DK5 oraz LK6 to pochodne temporyny-1CEb, natomiast peptyd KSLW to związek pochodzący z biblioteki kombinatorycznej. Badania wykazały, że infekcja wywołana HSV-1 najwydajniej hamowana jest przez koniugat DAL-PEG-LK6. Stężenie powodujące zahamowanie replikacji HSV-1 o 50% dla DAL-PEG-LK6 wynosi 9,31 μg/ml. Działanie przeciwwirusowe DAL-PEG-LK6 zostało potwierdzone również przy pomocy cytometrii przepływowej oraz mikroskopii konfokalnej. Co więcej, wykazano, że mechanizm działania koniugatu opiera się na bezpośredniej inaktywacji wirionów HSV-1 przez badany związek. W ostatnim etapie eksperymentów oceniono wpływ badanych peptydów na odpowiedź komórek gospodarza indukowaną ścieżką sygnalną przekazu komórkowego inicjowaną aktywacją receptora TLR3 (z ang. toll like receptor). Otrzymane dane pozwalają stwierdzić, że spośród testowanych związków, najefektywniej działającym koniugatem jest DAL-PEG-LK6 wykazującym wysoką aktywność antywirusową względem wirusa opryszczki typu 1 i prowadzącym do zaburzenia kaskady sygnałowej TLR3.Antimicrobial peptides, besides microbicidal activity, have immunomodulatory and anticancer properties. The formation of conjugates composed of peptides with a wide range of therapeutic properties, which are non-toxic to eukaryotic cells, is a promising field to design more specific and safe drugs. The subject of this study was to investigate the effect of three peptide conjugates (DAL-PEG-DK5, DAL-PEG-KSLW and DAL-PEG-LK6) against infection with the herpes simplex virus type 1 (HSV-1). The tested compounds are formed from synthetic enkephalin analog (DAL), peptide showing pro-proliferative properties, reducing oxidative stress and pain, with synthetic antimicrobial peptides: DK5, KSLW, LK6. The DK5 and LK6 peptides state the analogous of temporin-1CEb, while the KSLW is a synthetic peptide derived from the combinatorial library of compounds. Presented studies have shown that HSV-1 infection is efficiently inhibited by the DAL-PEG-LK6 conjugate as IC50 value was 9,31 μg/ml. The antiviral activity of DAL-PEG-LK6 was further confirmed by flow cytometry and confocal microscopy. Detailed analysis of molecular activity of tested compound revealed the direct inactivation of HSV-1 virions. Finally, the influence of tested peptide conjugates on TLR3 signaling pathway in host cells induced by tested virus was examined. Obtained results allow concluding that among the tested compounds, the most effective conjugate is DAL-PEG-LK6, which shows high antiviral activity against the herpes virus type 1 but also inhibits the TLR3 signaling cascade

The effect of DAL-PEG-DK5 conjugate on the survival of Staphylococcus aureus in keratinocytes

Zwiększająca się ilość antybiotykoopornych szczepów bakteryjnych jest globalnym problemem opieki zdrowotnej. Jednymi z głównych oportunistycznych szczepów identyfikowanych między innymi w zakażeniach wewnątrzszpitalnych są szczepy MRSA (ang. Methycilin Resistant Staphylococcus aureus), wykazujące również znaczące zdolności do zmiany ekspresji genów kodujących czynniki zjadliwości, w odpowiedzi na zmieniające się środowisko. Peptydy antybakteryjne (AMPs z ang. antimicrobial peptides) należą do grupy związków, charakteryzujących się właściwościami przeciwdrobnoustrojowymi i są wydzielane przez większość organizmów. AMPs są obiecującymi potencjalnymi cząsteczkami terapeutycznymi i stanowią dobrą alternatywę dla antybiotyków. W niniejszej pracy przedstawiono wyniki badań prowadzonych przy użyciu koniugatu DAL-PEG-DK5, zbudowanego z syntetycznego analogu ludzkiej enkefaliny (DAL) oraz bogatego w lizynę analogu temporyny 1CEb (DK5). W pracy zaprezentowano wyniki dotyczące wpływu tego peptydu na przeżywanie metycylinoopornego szczepu USA300 S. aureus w ludzkich keratynocyach (HaCaT). Przedstawione badania wykazały istotne statystycznie zabijanie szczepu USA300 wewnątrz komórek HaCaT pod wpływem testowanego koniugatu DAL-PEG-DK5. W niniejszej pracy wykazano również mechanizm działania badanego związku, który w bardzo krótkim czasie (0-10 min) wnika do wnętrza bakterii uszkadzając ich błonę. Udowodnione działanie bakteriobójcze względem bakterii wewnątrzkomórkowych otwiera szerokie możliwości testowania związku w układach in vivo, a także może być punktem wyjściowym do projektowania kolejnych cząsteczek o podobnej budowie.The increasing number of antibiotic-resistant bacterial strains is a global problem of the health care system. Among the major opportunistic strains, which are common in nosocomial infections is MRSA S. aureus (Methicillin Resistant Staphylococcus aureus), which is characterized by the ability to change the gene expression encoding virulence factors in response to different environmental stimuli. Antimicrobial peptides (AMPs) belong to the group of compounds, which possess strong antimicrobial properties and are secreted by most of the organisms. AMPs are promising potential therapeutic molecules considered to be an alternative to antibiotics. This thesis presents the results of research conducted with usage of peptide conjugate DAL-PEG-DK5 composed of the synthetic analogues of enkephalin (DAL) and lysine-rich derivative of temporin 1CEb (DK5). The aim of the research was to evaluate the influence of DAL-PEG-DK5 on the intracellular persistence of S. aureus USA300 in the human keratinocyte cell line (HaCaT). The results clearly indicated that DAL-PEG-DK5 treatment significantly reduced intracellular level of USA300. Furthermore, the results demonstrated the molecular mechanism of tested compound, which in a very short time (0-10 min) passes through the bacteria membranes. Presented data showing efficient elimination of intracellular bacteria by tested peptide enables in vivo study and may also lead to the design of novel peptide-based compounds with similar structure