A membrane network of receptors and enzymes for adenine nucleotides and nucleosides

AbstractMost cells express more than one receptor plus degrading enzymes for adenine nucleotides or nucleosides, and cellular responses to purines are rarely compatible with the actions of single receptors. Therefore, these receptors are viewed as components of a combinatorial receptor web rather than self-dependent entities, but it remained unclear to what extent they can associate with each other to form signalling units. P2Y1, P2Y2, P2Y12, P2Y13, P2X2, A1, A2A receptors and NTPDase1 and -2 were expressed as fluorescent fusion proteins which were targeted to membranes and signalled like the unlabelled counterparts. When tested by FRET microscopy, all the G protein-coupled receptors proved able to form heterooligomers with each other, and P2Y1, P2Y12, P2Y13, A1, A2A, and P2X2 receptors also formed homooligomers. P2Y receptors did not associate with P2X, but G protein-coupled receptors formed heterooligomers with NTPDase1, but not NTPDase2. The specificity of prototypic interactions (P2Y1/P2Y1, A2A/P2Y1, A2A/P2Y12) was corroborated by FRET competition or co-immunoprecipitation. These results demonstrate that G protein-coupled purine receptors associate with each other and with NTPDase1 in a highly promiscuous manner. Thus, purinergic signalling is not only determined by the expression of receptors and enzymes but also by their direct interaction within a previously unrecognized multifarious membrane network

Role of PKC in the desensitization and crosstalk of G protein coupled receptors in the control of neuronal ion channels

Die Erregbarkeit von Neuronen wird durch eine Vielzahl von G Protein gekoppelten Rezeptoren kontrolliert, welche das "gating" von spannungsabhängigen Ionenkanälen regulieren. Um die Kinetik, die Signalkaskaden und gegenseitige Abhängigkeiten dieser Mechanismen näher zu untersuchen, beschäftigt sich dieses Dissertationsprojekt mit der Regulation von spannungsabhängigen Kalzium Kanälen und Kv7 Kalium Kanälen durch B2 Bradykinin und M1 Muscarin Rezeptoren in sympathischen Neuronen. Es ist allgemein bekannt, dass Bradykinin in Neuronen des sympathischen Nervensystems zwei gegensätzliche Anworten auslösen kann: Auf der einen Seite kommt es durch eine Hemmung von M-Typ K+ Kanälen zu einer Exzitation der Zellen und folglich zu einer Transmitter Freisetzung, aber auf der anderen Seite kommt es durch eine Hemmung von N-Typ Ca2+ Kanälen an der Präsynapse zu einer Hemmung diese Freisetzung. In früheren Arbeiten wurde klar, dass diese beiden Phänomene mit einer unterschiedlichen Kinetik desensitivieren. Im ersten Teil dieser Arbeit untersuchten wir daher die Mechanismen, welche der Desensitivierung der beiden unterschiedlichen Antworten zugrunde liegen. Wir konnten zeigen, dass die Hemmung von Ca2+ Strömen durch Bradykinin ihr Maximum innerhalb einer Minute erreichte und sich unmittelbar danach abschwächte. Es zeigte sich, dass diese Desensitivierung der inhibitorischen Wirkung von der Proteinkinase C (PKC) abhängt, da eine Blockade von PKC sowohl durch die Behandlung mit Bisindolylmaleimid I als auch durch eine langfristige Verabreichung des Phorbol Esters PMA einerseits die Hemmung von Ca2+ Strömen signifikant verstärkte aber auch das Desensitivierungsverhalten verzögerte. Kalium induzierte Freisetzung von [3H] markiertem Noradrenalin aus Kulturen sympathischer Neurone wurde in einer ähnlichen Zeitabhängigkeit durch Bradykinin gehemmt wie sie in den Messungen von Kalzium Strömen festgestellt wurde. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen aus den Patch Clamp Experimenten war auch hier durch die Blockierung von PKC die Desensitivierung der Hemmung verlangsamt. Die Hemmung der M Typ Kalium Kanäle mittels Bradykinin erreichte ihr Maximum später, nach zwei Minuten, wobei die Desensitivierung der Antwort erst nach vier Minuten einsetzte. Die Hemmung von Ca2+ unabhängigen PKCs beeinflusste weder die maximale Hemmung von K+ Strömen signifikant noch die Desensitivierungskinetik. Weiters konnten wir aus den Experimenten, die die Internalisierung der Bradykininrezeptoren untersuchten, die Erkenntnis gewinnen, dass diese ohne Beteiligung von PKC abläuft. Zusammenfassend zeigen unsere Daten einen eindeutigen Unterschied in der Desensitivierung der hemmenden und erregenden Antworten von Bradykininreezptoren in sympathischen Nervenzellen, wobei der erregende Effekt durch PKC reguliert wird. Im zweiten Teil dieser Arbeit konnten wir zeigen, dass sich Bradykinin- und Muscarinrezeptoren verschieden bei der Hemmung von Kalzium Kanälen verhalten. Die Kinetiken der Hemmung durch die Aktivierung der beiden Rezeptoren unterscheiden sich deutlich. So erreicht die Hemmung des Ca2+ Stroms durch die Gabe von Bradykinin ihr Maximum erst nach 60 Sekunden, während der M1 Rezeptor Agonist Oxotremorine bereits nach 30 Sekunden zur maximalen Inhibition führte. Wurde Bradykinin zweimal hintereinander appliziert, war es nicht möglich beim zweiten Mal eine Hemmung hervorzurufen. Im Gegensatz dazu, führte eine zweimalige Applikation von Oxotremorine nicht zu einer derartigen Desensitivierung. In einer Reihe von Experimenten, konnten wir nachweisen, dass sich B2 und M1 Rezeptoren in ihrer Wirkung auf Ca2+ Ströme gegenseitig beeinflussen. Die Aktivierung von B2 Rezeptoren verhindert die Hemmung des Ca2+ Stroms durch M1 Rezeptoren. Dieser Effekt wird durch die Behandlung der Neurone mit BisindolylmaleImid I verhindert. Das wiederum verdeutlicht die wichtige Rolle der PKC bei diesem Zusammenspiel. Betrachtet man die Hemmung der M-Ströme, so wurde kein Unterschied festgestellt wenn Bradykinin vor oder nach der Aktivierung der M1 Rezeptoren appliziert wurde. Obwohl der Signalweg der B2 und M1 Rezeptoren G[alpha]q gekoppelt ist und die gleiche Signalkaskade ausgelöst wird, scheint dennoch die exakte Abfolge der Transmittersequenz eine wesentliche Rolle im "Fine Tuning" an sympathischen Neuronen zu spielen.The excitability of neurons is tightly controlled by a variety of GPCRs, which finetune the gating of voltage dependent ion channels. To further investigate the kinetics, signaling cascades and interdependences of these mechanisms, this thesis project focused on the regulation of voltage gated calcium channels and Kv7 channels in sympathetic neurons via B2 bradykinin and M1 muscarinic receptors. Bradykinin is known to exert two opposing actions in rat sympathetic neurons via B2 receptors: an inhibition of M type K+ currents IM which leads to a stimulation of transmitter release and an inhibition of N-type Ca2+ currents (ICa) which leads to a presynaptic inhibition of transmitter release. In the first part of the present work we investigated the mechanisms underlying the desensitization of these two types of responses upon extended treatment with agonist. We could show that inhibition of Ca2+ currents by bradykinin, underlying the inhibitory response, reached a maximum within 1 min and the inhibition started to decrease immediately. The desensitization of the inhibition involves protein kinase C (PKC), since blocking PKC by either bisindolylmaleimide I or long time phorbol ester treatment enhanced the reduction of Ca2+ currents significantly, while the desensitization of the response got delayed. K+-evoked release of [3H] labelled noradrenaline from rat superior cervical ganglia cultures was inhibited by bradykinin in a time-dependent manner similarly to the measurements of ICa. In accordance with the patch-clamp data, the desensitization of this inhibition was also slowed after blocking PKC. The inhibition of M-type K+ currents by bradykinin, representing the stimulatory effect, reached a maximum after 2 min and the desensitization of the response started after 4 min only. Blocking Ca2+ independent PKCs did neither alter the maximal inhibition of K+ currents nor was the desensitization kinetic significantly altered. Our results show that the inhibitory and stimulatory actions of B2 bradykinin receptors in sympathetic neurons desensitize with different time courses. Furthermore, PKC is only involved in the regulation of the desensitization of the inhibitory actions, but not of the excitatory action. In addition our experiments investigating the internalization of B2 receptors caused by its natural peptide lead to the conclusion that this happens independent of PKC activation. In the second part of this work we could show that bradykinin B2 and muscarinic M1 receptors act differently in inhibiting calcium channels. The kinetics of inhibition clearly differ as ICa was maximally inhibited by bradykinin after 60 s, while the M1 agonist oxotremorine M (OxoM) leads to the maximal reduction of ICa already after 30 s. When bradykinin had been applied for 120 s once, it was not possible to induce an inhibition by the peptide again. In contrast to this, the inhibition induced by OxoM did not show such a clear desensitization. In a set of experiments we could show that the B2 and the M1 receptor influence each other at the level of ICa inhibition. Activation of B2 receptors prevents inhibition of ICa via M1 receptors. This effect is prevented by treating the neurons with bisindolylmaleimide I, indicating an important role of PKC in this interplay. At the level of M-currents no differences were obtained if bradykinin was given before or after the M1 receptor activation. These data indicates that although both, the B2 and M1 receptors, couple to G[alpha]q and thereby activate the same pathway, the precise sequence of transmitter actions plays an important role in the fine tuning of sympathetic neurons.by Kristina KosenburgerAbweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des VerfassersZsfassung in dt. SpracheWien, Med. Univ., Diss., 2010OeBB(VLID)188334