Vor-Ort-Charakterisierung von aquatischen Huminstoffen und ihren Metallspezies

Die Huminstoffe (HS) sind komplexe Mischungen sich ähnelnder refraktärer Makromoleküle, die durch mikrobiellen Abbau abgestorbener Biomasse in Böden und Wässern gebildet werden. HS stellen die wichtigste Senke für organischen Kohlenstoff in der Umwelt dar. Auf Grund ihrer strukturellen Vielfalt bzw. Polyfunktionalität sind HS an zahlreichen umweltrelevanten Prozessen beteiligt, insbesondere an starken Wechselwirkungen mit organischen und anorganischen Schadstoffen. Auch in vielen Gewässern besteht ein großer Teil des gelösten und partikulären organischen Kohlenstoffs ("DOC" und "SOC") aus HS. In Verbindung mit anorganischen Wasserinhaltsstoffen, z.B. Al-, Fe- und Si-Oxidhydraten, können HS komplexe, leicht veränderliche Hydrokolloide bilden, die vermutlich ein hohes Metallbindungsvermögen besitzen. Bisher existieren jedoch nur begrenzt zuverlässige Informationen über organisch geprägte Gewässerkolloide und die von ihnen gebildeten Metallspezies. Die Charakterisierung von HS und ihrem Verhalten in Umweltkompartimenten, z.B. ihre Metallbindungsfomen, hat sich bisher vorwiegend auf isolierte HS, also auf einen operationell wesentlich veränderten "Ausschnitt" des ursprünglichen Hydrokolloids konzentriert. Hierbei ist prinzipiell unsicher, inwieweit die an artifiziellen HS-Metallkomplexen gewonnenen Erkenntnisse überhaupt auf die ursprünglichen Spezies übertragbar sind. Eine aus diesem Grund wünschenswerte in-situ-, zumindest aber Vor-Ort-Analytik an HS und ihren natürlichen Metallspezies in Gewässern war wegen unzureichender Verfahren bisher kaum möglich. Die Ziele der vorliegenden Arbeit waren deshalb Entwicklung, Aufbau und Anwendung einer leistungsfähigen Vor-Ort-Analytik für HS und ihre Metallspezies in huminstoffreichen Gewässern. Mit dieser Zielvorstellung war die Arbeit von 1997 bis 2000 auch eingebunden in das aktuelle DFG-Sonderschwerpunktprogramm ROSIG (Refraktäre organische Säuren in Gewässern) im Bereich der Wasserforschung. Nach der hierbei verfolgten Strategie sollten HS und ihre Metallspezies in ausgesuchten Gewässern mit geeigneten Feldmethoden nach Molekülgröße differenziert, UV/VIS-spektroskopisch charakterisiert und später im Labor mittels Atomspektrometrie, z.B. AAS, ICP-OES oder TRFA, hinsichtlich ihrer Metallgehalte analysiert werden. Zunächst wurde ein einfaches spektralphotometrisches Feldverfahren zur Bestimmung gelöster HS in Gewässern erarbeitet, auf Basis ihres überraschend wenig schwankenden spektralen Absorptionskoeffizienten (SAK) im UV-Bereich, vorzugsweise dem SAK bei 254 nm. Diese Untersuchungen wurden an zwei typischen Braunwasser-Seen (Hohlohsee (HO), Nordschwarzwald; Venner Moor (VM), Münsterland) und an einem HS-reichen Fließgewässer (Arnsberger Wald (AW), NRW) zu verschiedenen Jahreszeiten durchgeführt. Zum Richtigkeitsvergleich wurden konventionelle DOC-Bestimmungen im Labor herangezogen. Hierzu diente ein nachweisstarker thermographischer Kohlenstoff-Analysator. Von besonderer Relevanz war eine zuverlässige Größenklassierung der vorliegenden Gewässerkolloide, wobei deren physikalischer Zustand möglichst nicht durch Elektrolyte bzw. Puffer verändert werden sollte. Hierfür wurde eine mobile MST-UF-Einheit entwickelt, die einfache und gut reproduzierbare on-line Fraktionierungen der zu untersuchenden HS-Kolloide vom subpartikulären ( 100 bis < 3 kDa) ermöglichte. Die mit dieser Methodik untersuchten Kolloide wiesen meist Fraktionen von weniger als 10 % DOC-Anteil im subpartikulären Bereich auf, jedoch relativ hohe DOC-Anteile von über 50 % im niedermolekularen Bereich von < 3 kDa auf. Die natürlichen Metallspezies in den so gewonnenen HS-Größenfraktionen, z.B. die von Al, Ca, Cu, Fe, Mg, Mn, Pb und Zn, die im Labor vorzugsweise mittels ICP-OES analysiert wurden, zeigten auffällig unterschiedliche Verteilungsmuster. Sie waren häufig im Größenbereich von 10 bis 100 kDa angereichert (z.B. AW, VM), teilweise jedoch auch im subpartikulären Bereich (z.B. HO), wobei Metallgehalte von 1 bis 100 µg/mg DOC festzustellen waren. Signifikante strukturelle Unterschiede in den HS-Größenfraktionen, die zu diesem Zweck mittels 1H-NMR- und 2D-Fluoreszenz-Spektroskopie untersucht wurden, waren kaum zu beobachten. Lediglich ihr Absorbanzverhältnis A254/A436, zeigte eine gewisse Steigerung mit abnehmender Molekülgröße. Das Hauptziel der vorliegenden Arbeit war es, natürliche Metallspezies in huminstoffreichen Gewässern vor Ort nach ihrer thermodynamischen und kinetischen Stabilität zu differenzieren. Zur Unterscheidung zwischen HS-gebundenen und freien Metallfraktionen diente eine einfach durchführbare Feldtechnik auf Basis der Tangentialfluß-UF. Die so ermittelbaren konditionellen thermodynamischen Stabilitätskonstanten Ki natürlicher HS-Metallspezies lagen meist im Bereich von 103 bis 106 L/mol, je nach Element. Die kinetische Stabilität der vorliegenden HS-Metallspezies wurde operationell durch einen konkurrrierenden Austausch mit starken Liganden, z.B. EDTA, und Metallionen, z.B. Cu(II), vor Ort charakterisiert. Der Verlauf der Austauschreaktionen konnte durch zeitkontrollierte Tangentialfluß-UF mit einer zeitlichen Auflösung von zwei Minuten verfolgt werden. Die vor Ort untersuchten natürlichen Metallspezies, z.B. die von Al, Fe, Mn, Zn und Erdalkalien, tauschten mit EDTA nur relativ langsam aus, wobei die Gleichgewichte häufig erst nach 1000 bis 1500 Minuten erreicht wurden. Ihre Austauschkinetik folgte zwei Geschwindigkeitsschritten erster Ordnung, die z.B. beim Fe mit Halbwertszeiten t1/2 von 0.12 bis 0.39 h-1 bzw. 1.35 bis 46.2 h-1 abliefen. Auch bei EDTA-Überschuß erwiesen sich die untersuchten Metallspezies, z.B. die von Al und Fe, nur als teilweise austauschfähig, im Gegensatz zu artifiziellen, aus isolierten HS und Metallionen in-vitro gebildeten Spezies. Zudem konnte gezeigt werden, daß natürliche HS-Metallspezies, die nach ihrer Voranreicherung mittels UF für längere Zeit gelagert werden, stark an Metall-Verfügbarkeit verlieren. Die Verfügbarkeit von Metallen in natürlichen aquatischen Metallspezies wurde am Gewässer auch durch Austauschversuche mit Cu(II)-Ionen untersucht. Beladungen der vorliegenden HS mit hohen Konzentrationen an Cu(II) (oder auch anderen Metallionen) und nachfolgende Me-HS/Me-Trennung mittels zeitkontrollierter TF-UF ermöglichten zunächst die Ermittlung konditioneller Komplexierungskapazitäten, die für die untersuchten Metallionen zwischen 0.1 für Mn(II) über 1.1 für Cu(II) bis hin zu 4.66 mmol/g DOC für Fe(III) differierten. Damit konnte klar belegt werden, daß mit der sonst üblichen Angabe der Cu(II)-Komplexierungskazität das Metallbindungsvermögen von aquatischen HS nur unzureichend beschrieben ist. Aus den Beladungsgleichgewichten der HS bei niedrigen Metallkonzentrationen konnten außerdem konditionelle Stabilitätskonstanten Ki für die gebildeten Komplexe ermittelt werden. Der Austausch zwischen natürlichen HS-Metallspezies und konkurrierenden Cu(II)-Ionen erreichte innerhalb von zehn Minuten sein Gleichgewicht, also wesentlich schneller als der EDTA-Austausch. Allerdings lag die Al- bzw. Fe-Verfügbarkeit der untersuchten Spezies gegenüber Cu(II) mit 16-69 bzw. 2-27 % meist deutlich niedriger als die EDTA-Verfügbarkeit. Nach dem MWG konnte der Austausch zwischen den natürlichen HS-Spezies und zugesetzten Cu(II)-Ionen mit Hilfe von Austauschkonstanten Ka anschaulich beschrieben werden. Die so in verschiedenen Wasserproben ermittelten Ka-Werte lagen häufig im Bereich zwischen 0.01 für z.B. Al und Fe und 90 für z.B. Ca. Demnach lag die thermodynamische Stabilität der austauschfähigen natürlichen Al- bzw. Fe-Spezies etwa um den Faktor 100 höher, die der natürlichen Ca-Spezies etwa um den Faktor 100 niedriger als die des gebildeten HS-Cu(II)-Komplexes. Allerdings ergaben sich teilweise signifikante Unterschiede zwischen den untersuchten Wasserproben. Ein vergleichender Cu(II)-Austausch an natürlichen, durch UF vorangereicherten und artifiziellen Metallspezies desselben aquatischen HS (HO17) belegte außerdem erhebliche Unterschiede sowohl zwischen Metallaustausch durch Cu(II) (Ca, Mg und Sr ausgenommen), als auch in den betreffenden Austauschkonstanten Ka. Vor-Ort-Beladungen naturbelassener HS mit Mischungen verschiedener Metallionen wie Al(III), Cd(II), Cu(II), Fe(III), Mn(II), Ni(II), Pb(II), Zn(II) zeigten auf, daß diese nur wenig kompetitiv wirken, vorausgesetzt die Gesamtbeladung des HS bleibt weit unterhalb seiner Komplexierungskapazität. Die Erfassung möglicher Metallspezies-Transformationen in HS-reichen Wasserproben während ihrer Lagerung (0.45 µm-filtriert, 15 °C, Dunkelheit) war ein weiterer Schwerpunkt der Arbeit. Hierzu wurden die vor Ort gewonnenen Analysendaten dieser Proben auf etwaige Veränderungen während ihrer Lagerung untersucht. Praktisch keine Veränderungen ergaben sich bei den reinen Größenverteilungen der untersuchten Hydrokolloide, die sich auch nach vier Wochen Lagerung als unerwartet stabil erwiesen. Dies galt auch für die Gesamt-DOC-, weniger aber für die Fe- und Zn-Gehalte. Erhebliche Einbußen waren schon nach einer Woche bei der konditionellen KKCu(II) zu verzeichnen, trotz stabil gebliebener DOC-Werte. Signifikanten Veränderungen waren auch die natürlichen Metallspezies in den gelagerten Wasserproben hinsichtlich EDTA- und Cu(II)-Austausch unterworfen. Die Austauschfähigkeit nahm in der Regel deutlich ab, in Einzelfällen (HO16) aber auch deutlich zu. Bei den Cu(II)-Austauschkonstanten Ka der untersuchten Metallspezies waren ähnlich auffallende Veränderungen zu beobachten, aus denen, je nach Probe und betrachtetem Metall, eine formale Minderung aber auch eine Steigerung der Speziesstabilität relativ zum Cu(II) abzuleiten war. Strukturelle Transformationen der gelagerten HS waren jedoch weder mittels 1H-NMR noch 2D-Fluoreszenz nachweisbar. Die hier festgestellten Veränderungen in gelagerten Wasserproben untermauern also im nachhinein die Notwendigkeit, aquatische HS und ihre Metallspezies möglichst schon direkt am Gewässer zu charakterisieren, um unerwünschte Artefakte und damit verbundene Interpretationsfehler zu vermeiden

Do-it-yourself: construction of a custom cDNA macroarray platform with high sensitivity and linear range

Background: Research involving gene expression profiling and clinical applications, such as diagnostics and prognostics, often require a DNA array platform that is flexibly customisable and cost-effective, but at the same time is highly sensitive and capable of accurately and reproducibly quantifying the transcriptional expression of a vast number of genes over the whole transcriptome dynamic range using low amounts of RNA sample. Hereto, a set of easy-to-implement practical optimisations to the design of cDNA-based nylon macroarrays as well as sample (33)P-labeling, hybridisation protocols and phosphor screen image processing were analysed for macroarray performance. Results: The here proposed custom macroarray platform had an absolute sensitivity as low as 50,000 transcripts and a linear range of over 5 log-orders. Its quality of identifying differentially expressed genes was at least comparable to commercially available microchips. Interestingly, the quantitative accuracy was found to correlate significantly with corresponding reversed transcriptase - quantitative PCR values, the gold standard gene expression measure (Pearson's correlation test p < 0.0001). Furthermore, the assay has low cost and input RNA requirements (0.5 mu g and less) and has a sound reproducibility. Conclusions: Results presented here, demonstrate for the first time that self-made cDNA-based nylon macroarrays can produce highly reliable gene expression data with high sensitivity and covering the entire mammalian dynamic range of mRNA abundances. Starting off from minimal amounts of unamplified total RNA per sample, a reasonable amount of samples can be assayed simultaneously for the quantitative expression of hundreds of genes in an easily customisable and cost-effective manner

The tumor-associated antigen RHAMM (HMMR/CD168) is expressed by monocyte-derived dendritic cells and presented to T cells

We formerly demonstrated that vaccination with Wilms' tumor 1 (WT1)-loaded autologous monocyte-derived dendritic cells (mo-DCs) can be a well-tolerated effective treatment in acute myeloid leukemia (AML) patients. Here, we investigated whether we could introduce the receptor for hyaluronic acid-mediated motility (RHAMM/HMMR/CD168), another clinically relevant tumor-associated antigen, into these mo-DCs through mRNA electroporation and elicit RHAMM-specific immune responses. While RHAMM mRNA electroporation significantly increased RHAMM protein expression by mo-DCs, our data indicate that classical mo-DCs already express and present RHAMM at sufficient levels to activate RHAMM-specific T cells, regardless of electroporation. Moreover, we found that RHAMM-specific T cells are present at vaccination sites in AML patients. Our findings implicate that we and others who are using classical mo-DCs for cancer immunotherapy are already vaccinating against RHAMM

Alkynamide phthalazinones as a new class of TbrPDEB1 inhibitors

Several 3′,5′-cyclic nucleotide phosphodiesterases (PDEs) have been validated as good drug targets for a large variety of diseases. Trypanosoma brucei PDEB1 (TbrPDEB1) has been designated as a promising drug target for the treatment of human African trypanosomiasis. Recently, the first class of selective nanomolar TbrPDEB1 inhibitors was obtained by targeting the parasite specific P-pocket. However, these biphenyl-substituted tetrahydrophthalazinone-based inhibitors did not show potent cellular activity against Trypanosoma brucei (T. brucei) parasites, leaving room for further optimization. Herein, we report the discovery of a new class of potent TbrPDEB1 inhibitors that display improved activities against T. brucei parasites. Exploring different linkers between the reported tetrahydrophthalazinone core scaffold and the amide tail group resulted in the discovery of alkynamide phthalazinones as new TbrPDEB1 inhibitors, which exhibit submicromolar activities versus T. brucei parasites and no cytotoxicity to human MRC-5 cells. Elucidation of the crystal structure of alkynamide 8b (NPD-048) bound to the catalytic domain of TbrPDEB1 shows a bidentate interaction with the key-residue Gln874 and good directionality towards the P-pocket. Incubation of trypanosomes with alkynamide 8b results in an increase of intracellular cAMP, validating a PDE-mediated effect in vitro and providing a new interesting compound series for further studies towards selective TbrPDEB1 inhibitors with potent phenotypic activity

A Systematic Review of the Efficacy and Toxicity of Brachytherapy Boost Combined with External Beam Radiotherapy for Nonmetastatic Prostate Cancer

CONTEXT: The optimum use of brachytherapy (BT) combined with external beam radiotherapy (EBRT) for localised/locally advanced prostate cancer (PCa) remains uncertain.OBJECTIVE: To perform a systematic review to determine the benefits and harms of EBRT-BT.EVIDENCE ACQUISITION: Ovid MEDLINE, Embase, and EBM Reviews-Cochrane Central Register of Controlled Trials databases were systematically searched for studies published between January 1, 2000 and June 7, 2022, according to the Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-analyses (PRISMA) statement. Eligible studies compared low- or high-dose-rate EBRT-BT against EBRT ± androgen deprivation therapy (ADT) and/or radical prostatectomy (RP) ± postoperative radiotherapy (RP ± EBRT). The main outcomes were biochemical progression-free survival (bPFS), severe late genitourinary (GU)/gastrointestinal toxicity, metastasis-free survival (MFS), cancer-specific survival (CSS), and overall survival (OS), at/beyond 5 yr. Risk of bias was assessed and confounding assessment was performed. A meta-analysis was performed for randomised controlled trials (RCTs).EVIDENCE SYNTHESIS: Seventy-three studies were included (two RCTs, seven prospective studies, and 64 retrospective studies). Most studies included participants with intermediate-or high-risk PCa. Most studies, including both RCTs, used ADT with EBRT-BT. Generally, EBRT-BT was associated with improved bPFS compared with EBRT, but similar MFS, CSS, and OS. A meta-analysis of the two RCTs showed superior bPFS with EBRT-BT (estimated fixed-effect hazard ratio [HR] 0.54 [95% confidence interval {CI} 0.40-0.72], p &lt; 0.001), with absolute improvements in bPFS at 5-6 yr of 4.9-16%. However, no difference was seen for MFS (HR 0.84 [95% CI 0.53-1.28], p = 0.4) or OS (HR 0.87 [95% CI 0.63-1.19], p = 0.4). Fewer studies examined RP ± EBRT. There is an increased risk of severe late GU toxicity, especially with low-dose-rate EBRT-BT, with some evidence of increased prevalence of severe GU toxicity at 5-6 yr of 6.4-7% across the two RCTs.CONCLUSIONS: EBRT-BT can be considered for unfavourable intermediate/high-risk localised/locally advanced PCa in patients with good urinary function, although the strength of this recommendation based on the European Association of Urology guideline methodology is weak given that it is based on improvements in biochemical control.PATIENT SUMMARY: We found good evidence that radiotherapy combined with brachytherapy keeps prostate cancer controlled for longer, but it could lead to worse urinary side effects than radiotherapy without brachytherapy, and its impact on cancer spread and patient survival is less clear.</p

A Systematic Review of the Efficacy and Toxicity of Brachytherapy Boost Combined with External Beam Radiotherapy for Nonmetastatic Prostate Cancer

CONTEXT: The optimum use of brachytherapy (BT) combined with external beam radiotherapy (EBRT) for localised/locally advanced prostate cancer (PCa) remains uncertain.OBJECTIVE: To perform a systematic review to determine the benefits and harms of EBRT-BT.EVIDENCE ACQUISITION: Ovid MEDLINE, Embase, and EBM Reviews-Cochrane Central Register of Controlled Trials databases were systematically searched for studies published between January 1, 2000 and June 7, 2022, according to the Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-analyses (PRISMA) statement. Eligible studies compared low- or high-dose-rate EBRT-BT against EBRT ± androgen deprivation therapy (ADT) and/or radical prostatectomy (RP) ± postoperative radiotherapy (RP ± EBRT). The main outcomes were biochemical progression-free survival (bPFS), severe late genitourinary (GU)/gastrointestinal toxicity, metastasis-free survival (MFS), cancer-specific survival (CSS), and overall survival (OS), at/beyond 5 yr. Risk of bias was assessed and confounding assessment was performed. A meta-analysis was performed for randomised controlled trials (RCTs).EVIDENCE SYNTHESIS: Seventy-three studies were included (two RCTs, seven prospective studies, and 64 retrospective studies). Most studies included participants with intermediate-or high-risk PCa. Most studies, including both RCTs, used ADT with EBRT-BT. Generally, EBRT-BT was associated with improved bPFS compared with EBRT, but similar MFS, CSS, and OS. A meta-analysis of the two RCTs showed superior bPFS with EBRT-BT (estimated fixed-effect hazard ratio [HR] 0.54 [95% confidence interval {CI} 0.40-0.72], p &lt; 0.001), with absolute improvements in bPFS at 5-6 yr of 4.9-16%. However, no difference was seen for MFS (HR 0.84 [95% CI 0.53-1.28], p = 0.4) or OS (HR 0.87 [95% CI 0.63-1.19], p = 0.4). Fewer studies examined RP ± EBRT. There is an increased risk of severe late GU toxicity, especially with low-dose-rate EBRT-BT, with some evidence of increased prevalence of severe GU toxicity at 5-6 yr of 6.4-7% across the two RCTs.CONCLUSIONS: EBRT-BT can be considered for unfavourable intermediate/high-risk localised/locally advanced PCa in patients with good urinary function, although the strength of this recommendation based on the European Association of Urology guideline methodology is weak given that it is based on improvements in biochemical control.PATIENT SUMMARY: We found good evidence that radiotherapy combined with brachytherapy keeps prostate cancer controlled for longer, but it could lead to worse urinary side effects than radiotherapy without brachytherapy, and its impact on cancer spread and patient survival is less clear.</p

PRegnancy Outcomes after a Maternity Intervention for Stressful EmotionS (PROMISES): study protocol for a randomised controlled trial

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>There is ample evidence from observational prospective studies that maternal depression or anxiety during pregnancy is a risk factor for adverse psychosocial outcomes in the offspring. However, to date no previous study has demonstrated that treatment of depressive or anxious symptoms in pregnancy actually could prevent psychosocial problems in children. Preventing psychosocial problems in children will eventually bring down the huge public health burden of mental disease. The main objective of this study is to assess the effects of cognitive behavioural therapy in pregnant women with symptoms of anxiety or depression on the child's development as well as behavioural and emotional problems. In addition, we aim to study its effects on the child's development, maternal mental health, and neonatal outcomes, as well as the cost-effectiveness of cognitive behavioural therapy relative to usual care.</p> <p>Methods/design</p> <p>We will include 300 women with at least moderate levels of anxiety or depression at the end of the first trimester of pregnancy. By including 300 women we will be able to demonstrate effect sizes of 0.35 or over on the total problems scale of the child behavioural checklist 1.5-5 with alpha 5% and power (1-beta) 80%.</p> <p>Women in the intervention arm are offered 10-14 individual cognitive behavioural therapy sessions, 6-10 sessions during pregnancy and 4-8 sessions after delivery (once a week). Women in the control group receive care as usual.</p> <p>Primary outcome is behavioural/emotional problems at 1.5 years of age as assessed by the total problems scale of the child behaviour checklist 1.5 - 5 years.</p> <p>Secondary outcomes will be mental, psychomotor and behavioural development of the child at age 18 months according to the Bayley scales, maternal anxiety and depression during pregnancy and postpartum, and neonatal outcomes such as birth weight, gestational age and Apgar score, health care consumption and general health status (economic evaluation).</p> <p>Trial Registration</p> <p>Netherlands Trial Register (NTR): <a href="http://www.trialregister.nl/trialreg/admin/rctview.asp?TC=2242">NTR2242</a></p