The Budgeting of Portuguese Public Museums: a dynamic panel data analysis

In this paper, the first panel on sources of funding for Portuguese publicly owned museums is explored. There has been little work in this field worldwide, and none for Portugal. Evidence in this paper seems contrary to that relating to the UK and to the US. We find that incremental budgeting still plays a major role on the funding of Portuguese museums, allowing for inefficient management and moral hazard: the interests of museums’ management may diverge clearly from those of the authorities ruling them and from those of the general public. We also find that the ability to generate their own revenues plays no role in the funding allocated to museums every year. Budgeting is mainly determined by past operating costs. Policy changes seem to be advisable. The scarce relevance of museum patronage by the private sector makes a discussion of possible crowding out effects irrelevant in the current Portuguese context.museums; incremental budgeting; moral hazard; dynamic panel data;

‘Quantitative Literature’ and the Interpretation of the Armed Conflict in Mozambique (1976-1992)

Este documento é uma tradução do livro publicado em português, “Pobreza e paz nos PALOP”, Sextante Editora (2009), ISBN 978-989-676-007-6Recently, a number of reputable academic establishments have observed the fast growth of a new literature about civil wars, based on quantitative methodologies and privileging economic explanations. This literature, mostly rooted on a comparative analysis, seeks to uncover tendencies which allow configuring an universal theory of the occurrence, with the purpose of not only understanding but additionally informing the political decisions of organisms which are supposed to be managing it. The present article aims to bring subsidies for the discussion of the Mozambican case study under the stance of this new quantitative literature, trying to determine in which manner it may be useful to circumscribe and comprehend it

"Forty-one plus twenty-four is?": investigating on arithmetic processing in late bilinguals at low and high proficiency

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Comunicação e Expressão, Programa de Pós-Graduação em Inglês: Estudos Linguísticos e Literários, Florianópolis, 2023.Abstract: The field of numerical cognition has tried to understand the underlying mechanisms of how humans understand and process numerical information. Numerical information varies from seemingly simple actions such as choosing the cookie with the most chocolate chips, in which we try to recognize numerosity, to more complex actions such as multiplying or dividing, in which we need to manipulate precise numbers. Having in mind that most people need to deal with numerical information on a daily basis and that this mathematical processing is closely linked to the language that it has been taught, the current study tries to better understand how bilingual people deal with manipulating precise numerical information. The aim of this study, more specifically, is to investigate if more proficient speakers of an L2 are better at dealing with precise numerical information in their L2 and/or their L1 than less proficient speakers. In order to explore that, an online experiment was run with 36 Brazilian Portuguese-English (BP- EN) late bilingual participants of different proficiency levels in which they solved arithmetic problems of different complexities (one or two-digit problems), types (addition, subtraction, multiplication, or division), and language (English or Portuguese). Results show that proficiency plays a small role in arithmetic processing in the L2. In too-simple problems, proficiency did not yield a strong interaction with reaction times, whereas, in too-complex problems, a language overload surpassed L2 proficiency as an aid to solving the arithmetic operation. Hence, results demonstrate that proficiency has an effect on arithmetic processing and that this effect interacts with the complexity of the problems presented.A área da cognição numérica tem tentado entender os mecanismos subjacentes de como os seres humanos entendem e processam informações numéricas. Informações numéricas variam entre ações aparentemente simples como escolher o biscoito com mais gotas de chocolate, em que tentamos reconhecer numerosidade, ou ações mais complexas como multiplicar ou dividir, em que precisamos manipular números exatos. Tendo em mente que a maior parte das pessoas precisam lidar com informações numéricas diariamente, e que esse processamento matemático possui estreita ligação com a linguagem em que foi ensinado, o presente estudo tenta entender melhor como indivíduos bilíngues lidam com a manipulação de informações numéricas precisas. O propósito deste estudo, mais especificamente, é investigar se falantes de L2 mais proficientes lidam melhor com informações numéricas precisas em sua L2 e/ou sua L1, quando comparados à falantes menos proficientes de L2. A fim de explorar esta hipótese, foi realizado um experimento online com 36 falantes bilíngues tardios de Português Brasileiro-Inglês (PB- IN) com diferentes níveis de proficiência em que eles resolveram problemas aritméticos de diferentes complexidade (problemas de um ou dois dígitos), tipos (adição, subtração, multiplicação ou divisão) e língua (Português ou Inglês). Os resultados demonstram que a proficiência desempenha um papel limitado no processamento aritmético na L2. Em problemas demasiadamente simples, a proficiência não gerou uma interação significativa com os tempos de reação, ao mesmo tempo que em problemas demasiadamente complexos, uma sobrecarga linguística excedeu a proficiência na L2 em auxiliar a resolver o problema aritmético. Portanto, os resultados demonstram que a proficiência possui um efeito no processamento aritmético, e que esse efeito interage com a complexidade dos problemas apresentados

Evidencing Gatekeeping Relations through Narrativity

Seeking to illustrate the social processes involved in the research activity of gaining access to specific empirical contexts, this paper suggests the appropriateness of using narratives as analytical anchors, to explore and document the social relations maintained with and within business companies used as case studies, in the context of intensive, qualitative research endeavors. A doctoral research project focusing on studying business expatriation practices used in Portuguese multinational companies, is used as reference. This project development was punctuated by field access constraints and reluctant gatekeeping interactions, as well as unplanned research circumstances that implied the continuous negotiation of the research program's overall feasibility conditions. This paper discusses the plausibility of using narratives to illustrate, from an inside-out perspective, the social embeddedness of research projects involving sensitive topics and reluctant gatekeepers. Anchored in the use of a specific research narrative, five factors are discussed as possible field sites access enablers, arguing that the use of narratives can represent a gain for research processes discussion, providing increased methodological reflexivity opportunities

VCAM1 modulation on endothelial cells – implications for vasculopathy in sickle cell anemia

Sickle cell anemia (SCA) is a highly heterogeneous and multifactorial-like monogenic disease that arises from homozygosity for the c.20A>T mutation in the HBB gene. Vascular disease is systemic in SCA, with profound effects in organs like the brain, where stroke is the most severe end of the cerebral vasculopathy (CVA) spectrum. Endothelial dysfunction plays a major role in vasculopathy with several adhesion molecules, such as VCAM1, being produced by the endothelium altered as a response to inflammatory cytokine (e.g., TNF-α) signalling. In previous association studies, we found positive associations between the presence of four specific VCAM1 gene promoter haplotypes and i) high blood flow velocities in the median cerebral artery, and ii) a chronic hemolysis biochemical marker. In this study, we aimed to assess the functional role of those VCAM1 promoter haplotypes in endothelial cell response following endothelial activation through TNF-α stimulation. After molecular cloning of 3 haplotype constructs, using a pGL4 promoterless vector, haplotype sequence was confirmed, by Sanger sequencing, prior to transfection. We used EAhy926, HUVEC and HBEC as different endothelial cell models, and performed transfection experiments for each construct, with and without TNF-α stimulation. Differences in promoter activity were assessed by luciferase reporter assay. All haplotypes showed differences in promoter activity, after TNF-α stimulation, in all cell models. Haplotype 1 showed decreased promoter activity, while haplotypes 7 and 8 showed increased activity after TNF-α stimulation, in all cell models. These results are consistent with lower VCAM1 expression due to haplotype 1, and therefore a protective effect. Conversely, a higher expression due to haplotypes 7 and 8, suggests an increased vasculopathy risk, in a pro-inflammatory milieu. The association between specific haplotypes and endothelial cell response further enhances the modifier effect of VCAM1 on endothelial dysfunction and its impact in SCA pathophysiology, as well as its potential role as a biomarker of SCA vasculopathy risk, severity and prognosis.This work was partially supported by INSA_202DGH720 project.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Estudo das propriedades psicométricas do Inventário da Qualidade dos Relacionamentos Interpessoais (IQRI): a qualidade dos relacionamentos interpessoais e sintomatologia depressiva numa amostra de adolescentes portugueses

Dissertação de mestrado em Psicologia Clínica e Saúde (Intervenções Cognitivas Comportamentais nas Perturbações Psicológicas e Saúde), apresentada à Faculdade de Psicologia e Ciências da Educação da Universidade de CoimbraO objetivo deste estudo é explorar as propriedades psicométricas do Inventário da Qualidade dos Relacionamentos Interpessoais (IQRI), versões para a mãe e para o pai, para a população portuguesa, e estudar as relações que se estabelecem entre a qualidade das relações interpessoais e a sintomatologia depressiva. Foi realizada uma análise fatorial confirmatória (CFA), para confirmar a estrutura fatorial sugerida por Pierce, Sarason & Sarason (1991). A amostra consistiu em 312 adolescentes, 171 do sexo feminino e 141 do sexo masculino, entre os 12 e 17 anos de idade (M= 13.77,DP= 1.16), estudantes de escolas públicas portuguesas. O IQRI - versão pai é um instrumento composto por 20 itens distribuídos por três fatores, que avaliam as dimensões de Suporte, Conflito e Profundidade. A versão mãe é composta por 16 itens, distribuídos por três fatores, que avaliam, de igual forma, as dimensões de Suporte, Conflito e Profundidade. Os resultados mostram associações positivas entre as subescalas de suporte e profundidade, de outro modo, encontram-se associações negativas entre estas subescalas e a subescala de conflito. Do estudo da validade convergente e divergente conclui-se que, nas duas versões, os fatores suporte e profundidade correlacionaram-se positivamente com a medida de suporte social geral e bem-estar subjetivo, e negativamente com a solidão. Por outro lado, o fator conflito encontra-se associado de forma, negativa com a medida de suporte social geral e bem-estar subjetivo e positiva com a medida de solidão. A escala apresenta uma consistência interna adequada, apresentando alfas que variam de .78 a .83, validade de constructo (convergente e divergente) adequada e boa estabilidade temporal, na amostra em estudo. O presente estudo revela, também, que a perceção de apoio social específico está negativamente correlacionada com sintomatologia depressiva. Por sua vez a perceção de conflito no relacionamento está positivamente associada à sintomatologia depressiva. Constatou-se, ainda, que a qualidade das relações que o adolescente estabelece com o pai e com a mãe é preditiva de sintomatologia depressiva, embora a percentagem de variância explicada se revele baixa. Todavia são necessários mais estudos que utilizem este instrumento, o qual se revelou adequado na presente amostra, para complementar o estudo das suas características psicométricas, afim de complementar a adaptação portuguesa do IQRI.The aim of this study was to examine the psychometric proprieties of the Quality of Relationships Inventory (QRI), father and mother versions, for the Portuguese population; and investigate the impact of the quality of interpersonal relationships on depressive symptomatology. Confirmatory Factor Analyses (CFA) were performed to confirm the factorial structure suggested by Pierce, Sarason &Sarason (1991). The sample consisted of 312 adolescents (171 females, 141 males; age: M = 13.77, SD = 1.16, range: 12-17 years old) from public Portuguese schools. The 20-item QRI father version assesses three dimensions: Support, Conflict and Depth. The 16-item mother version also includes the same three dimensions: Support, Conflict and Depth. Results revealed significant positive associations between the Support and Depth subscales and negative associations between the Support and Conflict measures, and Depth and Conflict for both mother and father versions. Furthermore, results achieved in convergente and divergente validity showed that the Support and Depth dimensions for mother and father versions were positively correlated with the general social support measure and negatively correlated with loneliness. The Portuguese version of the QRI scale reveals high internal consistency, presenting alpha ranging from .78 to .83, construct validity (convergent and divergent) and temporal stability Moreover, perception of support and specific social support was negatively correlated with depressive symptomatology and the perception of conflict in relationships was positively correlated with depressive symptomatology. Results also suggested that the quality of the relationship between adolescences and mother-father is a low predictor of depressive symptomatology. Therefore we propose this Portuguese QRI scale is appropriate for the Portuguese population. However, further research is necessary to investigate the psychometric properties of this measure in order to complement the Portuguese adaptation of the QRI scale

Signalling pathways in cystic fibrosis: a cross talk between CFTR trafficking and inflammation mechanisms

Tese de mestrado, Bioquímica (Bioquímica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015Cystic Fibrosis (CF) is the most common lethal autosomic recessive disease among the Caucasians. The disease is caused by mutations in the CFTR gene, that encodes a chloride channel expressed at the apical membrane of epithelial cells. CFTR dysfunction causes the electrolyte unbalance found in exocrine epithelia, leading to mucus thickening and bacteria entrapment in the lung. The inflammatory response is inefficient and exacerbated leading to tissue damage, fibrosis and lung failure. The TGF-β pathway is over activated in CF and is one of the major factors leading to inflammation, fibrosis, EMT, and also to a reduction in CFTR levels. One of the cellular mechanisms responsible for the inhibition of the TGF-β pathway is the dephosphorylation of one of its associated receptors, TβRI, by PP1c. Previous reports have shown that PP1c interacts with LMTK2, a kinase that regulates CFTR endocytosis. The present work aimed to study the role of LMTK2, and its inhibitory effect in PP1c, in the activation of the TGF-β pathway seen in CF. Our results in bronchial epithelial cells show that TβRI and PP1c interact in vivo and that this interaction is destabilized by the presence of TGF-β. Additionally, treatment with TGF-β increases LMTK2 interaction with PP1c. TGF-β decreased CFTR expression, but this change was not significant, probably due to use of a CFTR-overexpressing cellular model. TGF-β-induced EMT was assessed through the differential expression of E- and Ncadherin after incubation with TGF-β for 24 h. T320A-PP1c, a variant of the phosphatase that is not responsive to inhibitory phosphorylation, was able to lead to an arrest of EMT, as seen by a stabilization of N-cadherin levels even after TGF-β incubation. Overall, this work provided some molecular insight on how some focal, unexplored, targets of the TGF-β pathway, can be set as underlying causes to the major phenotypical hallmarks in CF.A Fibrose Quística (FQ) é a doença autossómica recessiva letal mais comum na população caucasiana. Fenotipicamente, a doença manifesta-se principalmente por uma alta concentração salina no suor e por insuficiência pancreática e pulmonar. A doença é causada por mutações no gene CFTR (do inglês Cystic Fibrosis Transmembrane Condunctance Regulator) que codifica uma proteína com 1480 resíduos de aminoácidos que partilha o mesmo nome. Esta proteína funciona como um canal de cloreto e outros aniões na membrana apical das células epiteliais. Desde a clonagem do gene em 1989, foram já descritas mais de 2000 mutações possíveis causadoras de doença. Estas mutações levam a uma baixa taxa de síntese, à incorreta localização e/ou à falta de função da proteína CFTR e causam um desequilíbrio homeostático salino nas superfícies epiteliais exócrinas, com consequente aumento da viscosidade do muco associado. Estas alterações levam a que a resposta imunitária ao nível das superfícies respiratórias seja severamente diminuída, permitindo a colonização dos pulmões por estirpes bacterianas tais como Staphylococcus aereus e Pseudomonas aeruginosa. Foi ainda descrito que mesmo na ausência de infecções bacterianas, se desenvolve uma resposta inflamatória exacerbada que geralmente culmina na insuficiência respiratória e na morte. A mutação mais comum está presente em cerca de 85% dos doentes (em pelo menos um alelo) e leva à deleção de um resíduo de fenilalanina na posição 508 da cadeia polipeptídica (F508del). A proteína F508del-CFTR fica retida no retículo endoplasmático da célula por não adquirir o folding correto, sendo depois enviada para degradação pelo sistema ubiquitina-proteasoma. Caso a proteína mutada consiga ser enviada para a membrana plasmática através de mecanismo de correção, tanto a sua atividade como canal de cloreto, como a sua estabilidade na membrana estão diminuídas em relação à proteína wt-CFTR. Alguns compostos como o VX-809 (Lumacaftor) conseguem resgatar a proteína F508del- CFTR para a membrana plasmática (corretores), enquanto outros, como o VX-770 (Iva-caftor, KalydecoTM) conseguem potenciar a sua função como canal de cloreto (potenciadores). O VX-770 foi aprovado para tratar doentes que possuam uma de dez mutações geradoras de defeitos de gating, entre as quais a G551D (cerca de 4-5% dos doentes). Recentemente foi também aprovada a combinação do VX-809 e do VX-770, OrkambiTM, para doentes a partir dos 12 anos, homozigóticos para F508del. No microambiente pulmonar, a combinação da disfunção da CFTR com a colonização por estirpes bacterianas leva ao aumento dos níveis de mediadores pró-inflamatórios, os principais responsáveis pela remodelação epitelial observada. Um dos genes mais polimórficos em pacientes, e cuja via de sinalização está sobre-activada, é o do TGF-β. Esta sobre-activação é capaz de desencadear tanto o processo inflamatório, como o de fibrose, observado em pulmões de doentes FQ, sendo por isso um forte candidato a terapias direcionadas. Para além disto, o TGF-β diminui a expressão da proteína CFTR em células de doentes FQ homozigóticos para F508del, e desencadeia o processo de transição epitéliomesênquima (EMT, do inglês epythelial-to-mesenchimal transition). Na membrana plasmática, a ligação do TGF-β a um dos seus receptores, TGF-βRII, leva à heterodimerização deste último com o seu "contra-par", TGF-βRI. O heterodímero é depois responsável pela fosforilação de um conjunto de proteínas, incluindo os factores de transcrição Smad2/3. Na maior parte dos casos estas associam-se depois à Smad4, sendo o complexo translocado para o núcleo. Os genes alvo do complexo são transcritos, nomeadamente aqueles responsáveis pela ativação da resposta pró-inflamatória, pró-fibrótica e da EMT. A ativação constitutiva da via do TGF-β é usualmente prevenida pela ligação do TGF-βRI a um complexo proteico, no qual o proteína fosfatase 1c (PP1c, do inglês protein phosphatase 1c) é responsável pela desfosforilação do receptor, mantendo a via inibida em condições de repouso. O LMTK2 (Lemur tyrosine kinase 2 ) é um cinase capaz de fosforilar a proteína CFTR num resíduo de serina específico (S737), favorecendo a sua endocitose da membrana plasmática. Para além disto, o cinase foi ainda descrito como sendo capaz de fosforilar o resíduo de treonina 320 do PP1c, tornando o fosfatase inativo. Esta fosforilação será então suficiente para que o efeito inibitório que o PP1c tem na via do TGF-β seja suprimido, o que pode explicar parte da sobre-activação da via observada em CF. Usando uma linha celular com origem no epitélio brônquico humano pretendemos elucidar o mecanismo pelo qual o LMTK2 é capaz de regular a atividade do PP1c e a do via do TGF-β e como é que a modelação da atividade do cinase e do fosfatase contribuem para o desencadear do processo inflamatório, da EMT e da subexpressão de CFTR. Neste trabalho, através de co-imunoprecipitações em células incubadas, ou não, com TGF-β, mostrámos que em células CFBE wt-CFTR existe interação entre o TβRI e o PP1c, e que esta interação é desfavorecida na presença de TGF-β. Este resultado suporta o modelo no qual o PP1c tem efeito inibitório na via do TGF-β, através da desfosforilação inibitória. Verificámos também que, ao imunoprecipitar LMTK2, é possível detectar PP1c e que esta interação é favorecida em células incubadas com TGF-β. Numa segunda fase do trabalho estudámos o efeito do TGF-β sobre a expressão de CFTR. Observou-se um pequeno decréscimo na quantidade de proteína em células CFBE F508del-CFTR, embora esta descida não seja significativa. O principal problema reside provavelmente no facto de a proteína ser sobreexpressa neste modelo celular. Desta formar, o possível efeito do TGF-β na degradação de transcritos é mascarada pelos níveis de transcrição superiores àqueles observados em células com expressão endógena de CFTR. De forma a estudar o efeito do PP1c, estudos semelhantes aos descritos acima foram efectuados, através de transfecção com uma variante não passível de inibição por fosforilação, T320A-PP1c. Aqui, mais uma vez não se observou um decréscimo significativo nos níveis de CFTR, nem diferenças significativas entre a variante mutada de PP1c e a situação controlo (sobreexpressão de wt-PP1c). Os ensaios com células transfectadas com PP1c foram usados também para detectar os níveis de Smad2 fosforilada (indicativos da ativação da via do TGF-β) e de marcadores da EMT. Os níveis de pSmad2 aumentavam com a incubação de células com TGF-β, sendo no entanto necessários mais replicados de forma a tirar conclusões sobre a possível supressão da via aquando da transfecção com T320A-PP1c. A EMT foi estudada através da análise dos níveis de E- e N-caderina, sendo expectável uma diminuição dos níveis da primeira, e um aumento dos da segunda quando ocorre a transição. A incubação com TGF-β durante 24 h não é suficientes para levar a uma diminuição significativa dos níveis de E-caderina em células transfectadas com wt-PP1c. Por outro lado, em células transfectadas com GFP ou wt-PP1c, é possível observar um aumento significativo nos níveis de N-caderina, sugerindo a ocorrência de EMT parcial ao fim de 24 h. Adicionalmente,a transfecção de células com T320A-PP1c foi capaz de suprimir esta variação nos níveis de N-caderina, sugerindo que a não inibição do fosfatase é capaz de atenuar pelo menos um dos fenótipos causados pela ativação da via do TGF-β.O último conjunto de experiências consistiu no estudo de um grupo de mutantes do LMTK2 e do seu efeito nos níveis de PP1c e Smad2, quando ambos estão fosforilados. Os mutantes produzidos consistem num conjunto de variantes com efeitos diferentes na ativação, função e estrutura do cinase, e tornam-se numa boa aposta para o estudo da regulação exercida pelo LMTK2 na via em estudo. A incubação de células CFBE wt-CFTR com TGF-β durante 24 h, não levou à detecção de diferenças significativas nos níveis de PP1c fosforilado em T320, o que se deve à incapacidade do anticorpo usado para detectar especificamente a forma fosforilada do PP1c. O estudo dos níveis de pSmad2 foram ainda alargados a células com knockdown do LMTK2 por siRNAs. Tanto nestas condições, como em condições de sobreexpressão das diferentes variantes de LMTK2, foi detectado um aumento no nível de pSmad2 em células expostas ao TGF-β. No entanto, são necessários replicados adicionais de forma a tirar conclusões sobre variações nos níveis entre as diferentes variantes do cinase. Embora o estudo do papel do LMTK2 na via do TGF-β e as suas implicações na FQ necessitem ainda de ser aprofundados, este trabalho permitiu confirmar este cinase como um candidato forte a terapias para a doença. O seu papel celular dual na FQ – sinalização do TGF-β e endocitose de CFTR - e o facto de se tratar de um cinase, tornam-no um potencial alvo para terapias celulares no contexto da doença

Molecular characterization and functional analysis of ORF P1192R from African swine fever virus

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias. Especialidade de Ciências Biológicas e BiomédicasAfrican swine fever virus (ASFV) is a nucleo-cytoplasmic large DNA arbovirus and the single member of the family Asfarviridae. It infects soft ticks of the genus Ornithodoros as well as all members of the family Suidae, representing a global threat for pig husbandry for which there is currently no effective vaccine or treatment. Since the ASFV viral cycle is mainly cytoplasmic, it has been found/predicted to code for many components of the replicative and transcriptional machineries. Of these, and based in sequence homologies, a putative type II DNA topoisomerase-coding ORF (P1192R) was identified in the ASFV genome. DNA topoisomerases are enzymes that modulate the topological state of DNA molecules. They are ubiquitous and essential, participating in processes such as DNA replication, recombination and repair and also in transcription. Since ASFV has a large linear genome, with 170 to 190 kbp depending on the isolate, containing terminal inverted repeats and covalently closed ends, a type II topoisomerase may be indispensable for viral replication and/or transcriptional events. The main objectives of this work were to deepen the study on ORF P1192R and determine if it indeed codes for a type II DNA topoisomerase and, if so, to characterize its activity. Bioinformatics and phylogenetic analyses showed that ORF P1192R is highly conserved among the fourteen ASFV isolates analyzed and, although its amino acid sequence clearly diverges from other type II topoisomerases, the structural organization is preserved and conserved motifs and domains essential for activity are present. Transient expression of GFP-pP1192R in COS-7 cells revealed an exclusively cytoplasmic distribution of the protein, which remained unaltered by treatment with leptomycin B. Using Vero cells or swine macrophages infected with ASFV isolate Ba71V or L60, respectively, expression of pP1192R was observed in the late phase of infection, co-localizing with the viral factories, where the bulk of viral replication and transcription occurs. Heterologous expression of pP1192R in Saccharomyces cerevisiae demonstrated that it functionally complements a top2 thermo-sensitive mutation and that it exhibits ATP-dependent decatenation activity. The purified recombinant pP1192R was found to efficiently decatenate kDNA and to processively relax supercoiled plasmid DNA, which are characteristics of a type II topoisomerase. The optimal requirements in terms of pH, temperature and salt, divalent ions and ATP concentrations for pP1192R activity in vitro were determined and its sensitivity to a panel of topoisomerase poisons and inhibitors was tested. Our results indicate that P1192R may be a target for studying, and possibly controlling, ASFV transcription and replication.RESUMO - O vírus da peste suína africana (VPSA) é um arbovírus icosaédrico núcleo-citoplasmático de DNA de cadeia dupla, classificado no género Asfivirus da família Asfarviridae, da qual é o único membro conhecido. Este vírus infecta carraças do género Ornithodoros assim como todos os membros da família Suidae, constituindo uma ameaça global para a suinicultura para a qual não existe actualmente qualquer vacina ou tratamento. A prevenção da peste suína africana é feita através de medidas que visam reduzir o risco de introdução de animais ou produtos de origem animal infectados em regiões livres da doença, enquanto o controlo de um surto se baseia exclusivamente em medidas que incluem o abate sanitário de todos os animais susceptíveis na área do foco e a proibição de movimentos e comercialização de animais. Embora o VPSA tenha sido inicialmente descrito como um vírus com replicação exclusivamente citoplasmática, actualmente sabe-se que o núcleo da célula hospedeira é indispensável na fase inicial da infecção. Contudo, a grande maioria do ciclo infeccioso ocorre no citoplasma da célula infectada, não sendo por isso surpreendente que, das 150 a 167 grelhas de leitura aberta (ORF, do inglês “open reading frame”) identificadas no genoma do VPSA, algumas codifiquem para componentes das maquinarias de replicação e de transcrição. Dentre estas, prevê-se, com base em homologia de sequências aminoacídicas, que a ORF P1192R codifique para uma topoisomerase de DNA do tipo II. As topoisomerases de DNA estão presentes em todas as células e são responsáveis pela modulação do estado topológico do DNA, estado esse que se altera durante processos como a replicação, a recombinação e a reparação do DNA, assim como a transcrição, e dos quais resultam torções das moléculas de DNA que, não sendo resolvidas, podem comprometer a integridade genómica e consequentemente a viabilidade celular. Todas as topoisomerases exercem a sua actividade através da criação de quebras no DNA devido ao ataque nucleofílico de um resíduo de tirosina catalítico ao esqueleto fosfodiéster da molécula de DNA, gerandose assim uma ligação fosfotirosina covalente. As topoisomerases são classificadas em dois tipos, tendo por base a forma como quebram a molécula de DNA: as topoisomerases do tipo I, cuja actividade é independente de ATP e que geram quebras em cadeia única no DNA, facilitando assim o desenrolamento; e as topoisomerases do tipo II, que necessitam de ATP para gerar uma quebra nas duas cadeias do DNA, através da qual fazem passar uma dupla cadeia intacta. Considerando que o VPSA tem um genoma linear de grandes dimensões, com 170 a 190 quilopares de bases dependendo do isolado, e que contém repetições terminais invertidas fechadas covalentemente, uma topoisomerase do tipo II pode efectivamente ser essencial para eventos de replicação e/ou transcrição virais. Os objectivos centrais deste trabalho foram os seguintes: (i) realização de um estudo bioinformático e filogenético aprofundado da ORF P1192R do VPSA; (ii) estudo da proteína codificada por esta ORF (pP1192R), através da sua clonagem, expressão em sistema heterólogo, purificação da proteína recombinante e caracterização in vitro da sua actividade; (iii) determinação do efeito sobre a actividade da proteína recombinante dum painel de compostos químicos descritos como sendo inibidores de topoisomerases; (iv) identificação dos níveis de expressão e da localização intracelular da pP1192R em células infectadas pelo VPSA, a diferentes tempos de infecção; (v) avaliação do efeito de mutações dirigidas em resíduos ou motivos identificados como reguladores da actividade enzimática ou localização subcelular da pP1192R, tendo por base a informação gerada nos estudos bioinformáticos acima mencionados. A ORF P1192R do isolado L60 do VPSA foi amplificada por PCR e clonada e a sua sequência nucleotídica foi determinada e utilizada em análises bioinformáticas e filogenéticas. Verificou-se que esta ORF é altamente conservada entre os catorze isolados do VPSA cujo genoma se encontrava disponível nas bases de dados e, embora a sua sequência aminoacídica seja claramente divergente das de outras topoisomerases do tipo II incluídas neste estudo, quer sejam elas de origem procariota, eucariota ou viral, a organização estrutural da proteína está preservada e estão presentes motivos e domínios conservados que são essenciais para a actividade enzimática. O estudo da localização celular da pP1192R iniciou-se com a construção de plasmídeos quiméricos para a expressão da pP1192R em fusão com a proteína verde fluorescente (GFP) ou com uma variante vermelha (RFP). Transfectaram-se transientemente células de linha COS-7 com estas construções tendo-se observado que a proteína de fusão se distribuía exclusivamente pelo citoplasma. Esta distribuição não foi alterada após tratamento com leptomicina B que bloqueia uma das vias de exportação de proteínas do núcleo. Já a infecção das células a expressarem GFP-pP1192R com um isolado do VPSA adaptado a células Vero (Ba71V) induziu uma redistribuição da proteína de fusão, deixando de estar homogeneamente distribuída pelo citoplasma para estar principalmente concentrada nas fábricas virais a partir das 8 horas pós-infecção. Utilizando células de linha Vero infectadas com o isolado Ba71V, utilizado como modelo de infecção, ou macrófagos derivados de monócitos de sangue periférico de suíno (células alvo do vírus na infecção natural) infectados com o isolado virulento L60, e utilizando um soro anti-pP1192R produzido no decurso destes trabalhos, foi possível constatar que a pP1192R viral é produzida na fase intermédia/tardia da infecção (observável a partir das 6/8 horas pós-infecção) e que acumula nas fábricas virais ao longo da infecção. A expressão em sistema heterólogo da pP1192R iniciou-se num sistema procariota, baseado em Escherichia coli, mas embora tenha sido possível obter proteína recombinante em grandes quantidades, a sua purificação só foi conseguida recorrendo a agentes desnaturantes, impedindo a obtenção de proteína activa. Assim, avançou-se para um novo sistema de expressão baseado na levedura Pichia pastoris que apresenta diversas vantagens sobre o anterior, nomeadamente o facto de ser um sistema eucariota e por isso mais semelhante ao contexto em que a pP1192R é expressa em condições naturais. Contudo, neste sistema não foi possível obter proteína recombinante e o sistema foi abandonado. Tentou-se por fim a expressão heteróloga na levedura Saccharomyces cerevisiae. Neste organismo, a utilização das estirpes JCW26 e SD117 que contêm uma mutação termo-sensível no gene que codifica para a topoisomerase do tipo II endógena, permitiu demonstrar, quer in vivo através da complementação da mutação termo-sensível, quer in vitro recorrendo a ensaios funcionais de decatenação, que a pP1192R é efectivamente uma topoisomerase do tipo II funcional. Utilizando ainda S. cerevisiae como sistema de expressão, foi possível obter e purificar pP1192R recombinante para caracterização da sua actividade em ensaios funcionais in vitro. Observou-se que a pP1192R é capaz de relaxar DNA superenrolado, de decatenar DNA catenado e, quando em elevadas concentrações, de catenar DNA plasmídico, não tendo sido detectada actividade de superenrolamento de DNA relaxado. Determinaram-se também as condições óptimas de funcionamento em termos de temperatura, pH e concentrações de sal (NaCl ou KCl), ATP ou iões divalentes (Mg2+, Mn2+, Zn2+, Cu2+ e Ca2+), que foram posteriormente utilizadas para avaliar a sensibilidade da pP1192R recombinante a um painel de inibidores de topoisomerases, entre os quais se incluem drogas frequentemente utilizadas como agentes antimicrobianos ou antitumorais. Dos compostos testados, aqueles para os quais foram obtidos resultados mais promissores, i.e., os que revelaram níveis de inibição mais elevados, foram a coumermicina A1, a doxorubicina, a amsacrina e a genisteína. Pelo contrário, as quinolonas, normalmente utilizadas como antibióticos visando infecções provocadas por organismos procariotas, foram dos compostos com menor eficácia. Em suma, os resultados deste trabalho indicam que a ORF P1192R é um alvo promissor para o estudo e, eventualmente, o controlo dos processos replicativos e transcricionais do vírus da peste suína africana

How can packaging change children's eating habits from un-healthy food towards healthier options?

Field Lab: Children consumer behaviourThis experiment has the purpose of testing and measure the influence of packaging on children consumer behavior. More specifically, we seek to evaluate the impact that packaging can have on shifting children´s snack preferences from unhealthy food towards healthier options. The study was conducted through individual questionnaires done by 106 children aged from 7 to 9 years-old. There were two distinct groups in the sample (a control group and an experimental group) that were presented with two different visual options of a food snack each – a healthy option and a non-healthy one. The difference between the two groups was the packaging form of the healthy snack that they were presented with. Both groups were presented with the same packaging form for the unhealthy option. Results show that a healthy snack is more likely to have a positive impact on packaging overall evaluation, fun perception and preference over a non-healthy snack, if it is presented in a fun packaging, in contrast to a regular one, although it does not influence the taste perception of the product. Such findings suggest that packaging can be a powerful tool that can be used as a marketing strategy to promote healthy food as well as gain market share to non-healthy products