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Utilisation de l’acide poly (propyl acrylique) pour augmenter l’efficacité in vitro des nanoparticules à base de chitosane et ARN messager
L’ARNm a un fort potentiel en thérapie génique pour des applications de vaccination contre le
cancer, le remplacement de protéine défectueuse, l’édition du génome et la reprogrammation de
cellules souches. Néanmoins, la livraison de l’ARNm représente un défi scientifique et
technologique de taille, car elle est limitée par plusieurs barrières telles qu’une dégradation rapide
dans le plasma, la difficulté à pénétrer dans la cellule et une séquestration/dégradation au niveau
des endosomes. Cette barrière endosomale demeure à ce jour l’une des plus difficiles à franchir.
Pour surmonter certains de ces obstacles, plusieurs vĂ©hicules de livraison ont Ă©tĂ© dĂ©veloppĂ©s Ă
base de virus, lipides, polymères. Le chitosane (CS), un polymère naturel cationique, peut lier et
condenser les acides nucléiques pour former des nanoparticules, ce qui les protège et augmente
leur internalisation cellulaire. Toutefois, la capacité des nanoparticules à base de CS à surmonter
la séquestration endosomale demeure limitée et pourrait être augmentée par l’utilisation d’agents
endosomolytiques.
L’objectif principal de ce projet était d’incorporer l’acide poly(propyle acrylique)(PPAA), un
agent endosomolytique, à des nanoparticules de CS/ARNm dans le but d’accroître leur efficacité.
Le PPAA a été incorporé à différentes concentrations dans des nanoparticules binaires de
CS/ARNm. Les propriétés physico-chimiques (taille, PdI, potentiel-zeta, pH) et l’efficacité de
transfection in vitro des nouvelles formulations ternaires (CS/ARNm/PPAA) ont été
caractérisées. De plus, ces formulations ont été formées avec/sans tampon et en présence/absence
de tréhalose, une molécule utilisée pour la lyophilisation des nanoparticules. En présence de
tréhalose et tampon, le PPAA était principalement incorporé dans les nanoparticules qui avaient
une taille d’environ 170 nm et une charge de surface de 12 mV. Une augmentation de l’efficacité
de transfection (~10 fois) fut observée pour une concentration intermédiaire de PPAA en
présence de tampon et tréhalose. Par la suite, l’efficacité a été augmentée davantage en retirant le
tréhalose et en augmentant la concentration de mélange de l’ARNm. Cette nouvelle formulation a
atteint une efficacité comparable à ~86% du contrôle lipidique LipofectamineTM et ce sans aucun
signe de toxicité. Ces résultats suggèrent que la présence de PPAA dans les nanoparticules
favorise leur libération de l’endosome et/ou diminue leur stabilité. Néanmoins, des études de
trafic intracellulaire et compétition devront être effectuées afin de confirmer ces hypothèses.----------ABSTRACT
Messenger mRNA is a molecule that has a strong potential in gene therapy for a wide variety of
therapeutic applications such as vaccination against infectious disease or cancer, protein
replacement, genome editing and stem cells reprogrammation. However, delivery of mRNA
remains a scientific and technological endeavour as it is limited by many hurdles such as a fast
degradation in plasma, low internalisation kinetics and a sequestration/degradation within
endosomes. This endosomale barrier remains to day one of the hardest to overcome. To
overcome some of these hurdles, delivery vehicles made of virus, lipids or polymers are
developed worldwide. Chitosan (CS), a natural cationic polymer can bind and condense anionic
nucleic acids to spontaneously form nanoparticles. These nanoparticles protect mRNA and help
its cellular internalisation. However, the capacity of these nanoparticles to escape from
endosomes is limited and could be augmented by adding endosomolytique agents into the
nanoparticles.
The main objective of this project was to incorporate an endosomolytique agent in CS/mRNA
nanoparticle in order to increase their transfection efficiency. Poly(propylacrylic acid)(PPAA), an
anionic synthetic polymer was used as endosomolytique agent and added at different
concentrations in the binary (CS/mRNA) nanoparticles. These newly formed ternary
nanoparticles (CS/mRNA/PPAA) had their physicochemical characteristics (size, PdI, zetapotential,
pH) and transfection efficiency analysed. Furthermore, these formulations were made
with/without buffer and with/without trehalose, a disaccharide used for lyophilisation of
nanoparticles. In presence of buffer and trehalose, PPAA was mostly incorporated in the
nanoparticles that had a size of 170 nm and a zeta potential of 12 mV. An augmentation of
transfection efficiency (~10-fold) was observed for an intermediate PPAA concentration. This
bioactivity was further improved by removing threlaose and increasing the mRNA mixing
concentration while forming nanoparticles. This new optimal formulation reached a protein
expression levels comparable to ~86% of the lipid control LipofectamineTM 2000 messenger max,
without any signs of toxicity. These results suggest that PPAA in nanoparticles favorise their
endosomal release and/or decrease their stability. Nevertheless, further studies such as
intracellular trafficking and competition should be performed to confirm these hypotheses