Wheat straw degradation and production of alternative substrates for nitrogenase of Rhodobacter sphaeroides

Cellulose is a major component of plant biomass and could be applied in the production of biofuels, especially bioethanol. An alternative approach is production of a clean fuel - hydrogen from cellulosic biomass. In this paper an innovatory model of cellulosic waste degradation has been proposed to verify the possibility of utilization of cellulose derivatives by purple non-sulfur bacteria. The concept is based on a two-step process of wheat straw conversion by bacteria in order to obtain an organic acid mixture. In the next stage such products are consumed by Rhodobacter sphaeroides, the known producer of hydrogen. It has been documented that Cellulomonas uda expresses cellulolytic activity in the presence of wheat straw as an only source of carbon. R. sphaeroides applied in this research can effectively consume organic acids released from straw by C. uda and Lactobacillus rhamnosus and is able to grow in the presence of these substrates. Additionally, an increased nitrogenase activity of R. sphaeroides has been indicated when bacteria were cultivated in the presence of cellulose derivatives which suggests that hydrogen production occurs

6,4–PP Photolyase Encoded by AtUVR3 is Localized in Nuclei, Chloroplasts and Mitochondria and its Expression is Down-Regulated by Light in a Photosynthesis-Dependent Manner

search input Abstract Pyrimidine dimers are the most important DNA lesions induced by UVB irradiation. They can be repaired directly by photoreactivation or indirectly by the excision repair pathways. Photoreactivation is carried out by photolyases, enzymes which bind to the dimers and use the energy of blue light or UVA to split bonds between adjacent pyrimidines. Arabidopsis thaliana has three known photolyases: AtPHR1, AtCRY3 and AtUVR3. Little is known about the cellular localization and regulation of AtUVR3 expression. We have found that its transcript level is down-regulated by light (red, blue or white) in a photosynthesis-dependent manner. The down-regulatory effect of red light is absent in mature leaves of the phyB mutant, but present in leaves of phyAphyB. UVB irradiation does not increase AtUVR3 expression in leaves. Transiently expressed AtUVR3–green fluorescent protein (GFP) is found in the nuclei, chloroplasts and mitochondria of Nicotiana benthamiana epidermal cells. In the nucleoplasm, AtUVR3–GFP is distributed uniformly, while in the nucleolus it forms speckles. Truncated AtUVR3 and muteins were used to identify the sequences responsible for its subcellular localization. Mitochondrial and chloroplast localization of AtUVR3 is independent of its N-terminal sequence. Amino acids located at the C-terminal loop of the protein are involved in its transport into chloroplasts and its retention inside the nucleolus

Phototropin interactions with SUMO proteins

The disruption of the sumoylation pathway affects processes controlled by the two phototropins (phots) of Arabidopsis thaliana, phot1 and phot2. Phots, plant UVA/blue light photoreceptors, regulate growth responses and fast movements aimed at optimizing photosynthesis, such as phototropism, chloroplast relocations and stomatal opening. Sumoylation is a posttranslational modification, consisting of the addition of a SUMO (SMALL UBIQUITIN-RELATED MODIFIER) protein to a lysine residue in the target protein. In addition to affecting the stability of proteins, it regulates their activity, interactions and subcellular localization. We examined physiological responses controlled by phots, phototropism and chloroplast movements, in sumoylation pathway mutants. Chloroplast accumulation in response to both continuous and pulse light was enhanced in the E3 ligase siz1 mutant, in a manner dependent on phot2. A significant decrease in phot2 protein abundance was observed in this mutant after blue light treatment both in seedlings and mature leaves. Using plant transient expression and yeast two-hybrid assays, we found that phots interacted with SUMO proteins mainly through their N-terminal parts, which contain the photosensory LOV domains. The covalent modification in phots by SUMO was verified using an Arabidopsis sumoylation system reconstituted in bacteria followed by the mass spectrometry analysis. Lys 297 was identified as the main target of SUMO3 in the phot2 molecule. Finally, sumoylation of phot2 was detected in Arabidopsis mature leaves upon light or heat stress treatment

Phototropin interactions with SUMO proteins

The disruption of the sumoylation pathway affects processes controlled by the two phototropins (phots) of Arabidopsis thaliana, phot1 and phot2. Phots, plant UVA/blue light photoreceptors, regulate growth responses and fast movements aimed at optimizing photosynthesis, such as phototropism, chloroplast relocations and stomatal opening. Sumoylation is a posttranslational modification, consisting of the addition of a SUMO (SMALL UBIQUITIN-RELATED MODIFIER) protein to a lysine residue in the target protein. In addition to affecting the stability of proteins, it regulates their activity, interactions and subcellular localization. We examined physiological responses controlled by phots, phototropism and chloroplast movements, in sumoylation pathway mutants. Chloroplast accumulation in response to both continuous and pulse light was enhanced in the E3 ligase siz1 mutant, in a manner dependent on phot2. A significant decrease in phot2 protein abundance was observed in this mutant after blue light treatment both in seedlings and mature leaves. Using plant transient expression and yeast two-hybrid assays, we found that phots interacted with SUMO proteins mainly through their N-terminal parts, which contain the photosensory LOV domains. The covalent modification in phots by SUMO was verified using an Arabidopsis sumoylation system reconstituted in bacteria followed by the mass spectrometry analysis. Lys 297 was identified as the main target of SUMO3 in the phot2 molecule. Finally, sumoylation of phot2 was detected in Arabidopsis mature leaves upon light or heat stress treatment

The impact of sumoylation on phototropin controlled reactions

Światło jest kluczowym czynnikiem dla wzrostu i rozwoju roślin. Rośliny mają zdolność do reagowania na światło dzięki wyspecjalizowanym fotoreceptorom. Fototropiny są receptorami zaangażowanymi w odpowiedzi roślin na światło niebieskie i UVA. W genomie A. thaliana zidentyfikowano 2 geny kodujące fototropiny - PHOT1 i PHOT2. Fototropiny zaangażowane są w regulację fototropizmu, ruchów chloroplastów, otwierania aparatów szparkowych i pozycjonowania liści. W słabym świetle, w wyniku reakcji akumulacji, chloroplasty przemieszczają się pod ściany komórkowe prostopadłe do kierunku padania światła przyjmując tzw. położenie płaskie umożliwiające optymalizację absorpcji dostępnego światła. Reakcja ucieczki skutkuje położeniem profilowym chloroplastów pod ścianami równoległymi do kierunku padania światła. W tym położeniu chloroplasty unikają ekspozycji na silne światło zmniejszając jednocześnie prawdopodobieństwo uszkodzenia aparatu fotosyntetycznego. Obie fototropiny wspólnie kontrolują reakcję akumulacji chloroplastów pod wpływem światła o słabym natężeniu, ale tylko phot2 bierze udział w reakcji ucieczki chloroplastów wywołanej silnym światłem. Sumoilacja jest modyfikacją potranslacyjną polegającą na odwracalnym przyłączeniu do modyfikowanego białka małego białka SUMO (SMALL UBIQUITIN RELATED PROTEIN). Modyfikacja ta może blokować lub aktywować białka, zmieniać ich lokalizację i wpływać na interakcje. Sumoilacja może też ochraniać białka przed skierowaniem ich do degradacji. Warunki stresowe skutkują tworzeniem koniugatów z białkiem SUMO. Znaczenie tej modyfikacji pozostaje jedynie częściowo wyjaśnione. W roślinach sumoilacja pośrednio wpływa na rozwój, kwitnienie oraz strukturę korzeni. Genom Arabidopsis koduje 8 izoform SUMO, jednak większość prowadzonych badań dotyczy SUMO1, SUMO2, SUMO3 i SUMO5, ponieważ dla tych form znaleziono EST (Expressed Sequence Tags). Najważniejsze fizjologicznie są izoformy SUMO1 i SUMO2, gdyż podwójny mutant Atsum1sum2 jest letalny. Obie izoformy SUMO odpowiadają za reakcję na stres cieplny i solny u roślin. W genomie Arabidopsis zidentyfikowano cztery ligazy SUMO biorące udział w procesie sumoilacji: SIZ1 (SAP AND MIZ1), MMS21 (METHYL METHANE SULFONATE SENSITIVITY 21), PIAL1 i PIAL2 (PROTEIN INHIBITOR OF ACTIVATED STAT LIKE1 i 2). Ostatnio wykazano, że receptor światła czerwonego - fitochrom B jest sumoilowany poprzez przyłączenie SUMO1. W naszym laboratorium wykazano natomiast sumoilację Nkońcowej części fototropiny2. Głównym celem przeprowadzonych badań było sprawdzenie czy fototropina1 oddziałuje z białkami z rodziny SUMO oraz z ligazami uczestniczącymi w procesie sumoilacji. Druga część pracy dotyczyła wpływu sumoilacji na reakcje fizjologiczne kontrolowane przez fototropiny. Przeprowadzono analizy bioinformatyczne potwierdzające występowanie sekwencji aminokwasów o wysokim prawdopodobieństwie sumoilacji w obrębie PHOT1. Scharakteryzowano oddziaływania fototropiny1 z elementami szlaku sumoilacji metodą komplementacji fluorescencji (BiFC) in planta. W niniejszej pracy po raz pierwszy wykazano jądrową lokalizację fototropiny1 w oodziaływaniu z ligazą SIZ1. Dowiedziono, że po rekonstytucji systemu sumoilacji w E. coli, N-końcowy fragment fototropiny1 ulega modyfikacji przez białka SUMO. Sprawdzono również poziom ekspresji białek fototropin w liściach mutantów pozbawionych poszczególnych elementów szlaku sumoilacji: Atsum1, Atsum2, Atsum3, Atsum5, Atsiz1, Atmms21, Atpial1 i Atpial2. We wszystkich badanych mutantach ligaz z wyjątkiem Atpial2 zaobserwowano obniżoną ilość białka PHOT1 w porównaniu do Arabidopsis dzikiego typu zarówno w ciemności jak i na świetle. Mutant Atmms21 charakteryzuje się podwyższoną ilością PHOT2, natomiast mutant Atsiz1 wykazuje obniżony poziom tego białka w porównaniu do Arabidopsis dzikiego typu. Wyższy poziom białek - fototropiny1 i fototropiny2 - zaobserwowano również w mutancie Atsum5. Celem określenia fizjologicznej roli sumoilacji fototropin zbadano reakcje fizjologiczne kontrolowane przez fototropiny: indukowany światłem niebieskim ruch chloroplastów i fototropizm. Badania zostały przeprowadzone z użyciem mutantów szlaku sumoilacji oraz mutantów podwójnych, fototropinowych i ligazowych (Atphot1mms21, Atphot1siz1, Atphot2mms21, Atphot2siz1). W przypadku ruchów chloroplastów wykazano słabszą odpowiedź mutanta Atphot1mms21 na krótkie impulsy światła w porównaniu do Atphot1 oraz silniejszą odpowiedź na krótkie impulsy w Atphot1siz1. Zatem ligazy te wpływają na reakcje kontrolowane przez fototropinę2. Mutanty Atphot2mms21 i Atphot2siz1 wykazały słabszą niż Atphot2 akumulację w odpowiedzi na światło ciągłe, co sugeruje, że ligazy wpływają także na odpowiedzi zależne od phot1. Analizując kąt wygięcia fototropicznego siewek wykazano słabszy fototropizm w mutantach Atmms21, Atsiz1 i Atpial1 przy niskim natężeniu światła (0,01 μmol m-2 s-1) w porównaniu do Arabidopsis dzikiego typu, co może być związane z niższym poziomem PHOT1 w tych mutantach. Mutant Atpial2 wykazuje silniejszy fototropizm w stosunku do Arabidopsis dzikiego typu przy niskim natężeniu światła, może być to związane z wyższym poziomem PHOT1 w tym mutancie na świetle. Mutanty Atphot1mms21 i Atphot1siz1 wykazują słabszy fototropizm przy wyższym natężeniu światła (5 μmol m-2 s-1) niż rośliny dzikiego typu i mutanty pojedynczych genów ligaz, co świadczy o tym, że reakcja kontrolowana przez phot2 jest słabsza przy braku ligaz MMS21 lub SIZ1. Badania przeprowadzone w niniejszej pracy doktorskiej pozwalają na stwierdzenie, że phot1 jest substratem do modyfikacji przez białka SUMO. PHOT1 w oddziaływaniu z ligazą SIZ1 przyjmuje lokalizację jądrową. Elementy szlaku sumoilacji wpływają na poziom ekspresji białek fototropin zarówno w ciemności, jak i na świetle. Białka SUMO i ligazy sumoilacji regulują (bezpośrednio lub pośrednio) odpowiedzi fizjologiczne kontrolowane przez fototropiny, w szczególności fototropizm.Light plays an important role in plant's growth and development. Plants perceive light through specialized proteins called photoreceptors. Phototropins perceive blue and UVA light. Two genes have been identified in the Arabidopsis genome: PHOT1 and PHOT2. Phototropins are involved in phototropic bending, stomatal opening, leaf positioning and chloroplast movements. In weak blue light, chloroplasts move to periclinal walls in order to optimize light absorption. This is called the chloroplast accumulation response. In strong blue light, the avoidance response is observed as chloroplasts move away to the anticlinal walls in order to minimize damage of photosynthetic apparatus. Both phototropins control chloroplast accumulation response, but only phot2 regulates the avoidance response. Sumoylation is a posttranslational modification which results in a reversible attachment of a small SUMO (SMALL UBIQUITIN RELATED PROTEIN) protein to target proteins. Sumoylation can block or activate other proteins through changing their localization and interactions. Stress conditions result in SUMO conjugates formation. The importance of this modification is only partially discovered. Sumoylation regulates plant development, flowering and root structure. 8 SUMO isoforms are encoded in the Arabidopsis genome. Only isoforms SUMO1, SUMO2, SUMO3, SUMO5 are investigated, since their EST (Expressed Sequence Tags) have already been identified. Both isoforms SUMO1 and 2 are crucial for plant's life. The double Atsum1sum2 mutant is lethal. Isoforms SUMO1 and SUMO2 are responsible for heat and salt stress responses in plants. Four SUMO ligases have been identified in the Arabidopsis genome so far: SIZ1 (SAP AND MIZ1), MMS21 (METHYL METHANE SULFONATE SENSITIVITY 21), PIAL1 and PIAL2 (PROTEIN INHIBITOR OF ACTIVATED STAT LIKE1 and 2). It has been demonstrated that phytochrome B - a red light receptor is sumoylated by SUMO1. In our laboratory it has been shown that the N-terminus of phototropin2 is also sumoylated. The main objective of experiments performed in this thesis was to verify whether phototropin1 interacts with the SUMO protein family and SUMO ligases. The second part of the study focused on physiological responses controlled by phototropins. Bioinformatic analysis confirmed the occurrence of amino acid sequences with a high probability of sumoylation within PHOT1. Interactions between phototropin1 and proteins involved in the sumoylation pathway were characterized using the Bimolecular Fluorescence Complementation technique. In this work the nuclear localization of phototropin1 promoted by the interaction with SIZ1 was shown for the first time. It was also confirmed that the Nterminus of phototropin1 is modified by SUMO proteins using a sumoylation system reconstituted in E. coli. The levels of phototropin proteins were tested in mature leaves of wild-type Arabidopsis and the following mutants: Atsum1, Atsum2, Atsum3, Atsum5, Atsiz1, Atmms21, Atpial1 and Atpial2. Except for Atpial2, all tested mutants revealed lower levels of PHOT1 in comparison to the wild type, in both light and dark. The Atmms21 mutant exhibited higher PHOT2 levels, whereas the Atsiz1 mutant showed lower levels of PHOT2 in comparison with AtWT. Higher levels of both phototropins were found in the Atsum5 mutant. In order to determine the physiological role of phototropin sumoylation, light induced chloroplast movements and phototropism were investigated. Both responses are phototropin controlled. Experiments were performed using sumoylation pathway mutants and double - phototropin and ligase mutants (Atphot1mms21, Atphot1siz1, Atphot2mms21, Atphot2siz1). Weaker responses of chloroplasts to short blue light pulses were observed in the Atphot1mms21 mutant and stronger responses in Atphot1siz1, both in comparison to Atphot1. The conclusion is that ligases may influence phot2 controlled reactions. Both Atphot2mms21 and Atphot2siz1 mutants showed weaker accumulation in response to continuous blue light in comparison to Atphot2. This suggests that ligases may influence phot1 controlled responses. Phototropic curvature analysis showed weaker phototropism in mutants: Atmms21, Atsiz1 and Atpial1 under low light intensity (0,01 μmol m-2 s-1) than in wild type plants. This can be related to lower levels of PHOT1 observed in these mutants. The Atpial2 mutant exhibits stronger phototropism than AtWT in weak light, which may be related to higher PHOT1 levels in this mutant under light. Atphot1mms21 and Atphot1siz1 mutants showed weaker phototropism in higher light intensities (5 μmol m-2 s-1) than wild type plants or single ligase mutants. This suggests that the reaction controlled by phot2 is weaker in the absence of MMS21 or SIZ1 ligases. Experiments performed in this thesis enable to conclude that phot1 is modified by members of the SUMO protein family. PHOT1 can localize in the nucleus as a result of the interaction with SIZ1. Proteins involved in the sumoylation pathway influence the level of phototropin proteins in both dark and light. SUMO proteins and SUMO ligases regulate (directly or indirectly) physiological responses controlled by phototropins, especially phototropism

The analysis of straw degradation products formed by Cellulomonas uda as a potential substrates in the production of hydrogen by purple bacteria.

Celuloza jest głównym składnikiem biomasy roślinnej, którą możnawykorzystać do produkcji biopaliw, szczególnie bioetanolu. W tym celu wykorzystuje się mikroorganizmy posiadające właściwości celulolityczne i następnie hydrolizat poddaje się działaniu mikroorganizmów etanogennych. Inną możliwością jest produkcja z biomasy celulozowej czystego paliwa – wodoru. W niniejszej pracy zaproponowano nowatorski model wykorzystania odpadów celulozowych. Polega on na degradacji celulozy przez bakterie celulolityczne – Cellulomonas uda, połączonej zprzekształceniem cukrów prostych zawartych w hydrolizacie przez bakterieLactobacillus rhamnosus celem wytworzenia kwasów organicznych. W kolejnym etapie tak przygotowana mieszanina kwasów organicznych może być wykorzystana przez bakterie purpurowe, zdolne do produkcji wodoru w procesie fotofermentacji, na bazie różnorodnych związków organicznych. Celem niniejszej pracy było sprawdzenie możliwości utylizacji produktów rozkładu celulozy przez szczep Rhodobacter sphaeroides.Podstawowymi metodami wykorzystywanymi w przeprowadzonych badaniach były kolorymetryczne testy na aktywność celulaz wydzielanych przez C. uda oraz metoda HPLC, służąca do analizy ilościowej i jakościowej kwasów organicznych. W pierwszym etapie badań opracowano metodykę hodowli C. uda służącą do uzyskania wysokiej aktywności celulolitycznej, co osiągnięto przez dwustopniową hodowlę na odmiennych rodzajach pożywek. Z porównania rozkładu dwóch rodzajów słomyprzez C. uda uzyskano informację na temat profilu aktywności celulaz oraz stężeń kwasów organicznych i cukrów prostych uwalnianych ze słomy w hodowlach wielodniowych.Hydrolizat słomy uzyskany po kilkudniowej degradacji przy użyciu bakteriicelulolitycznych wykorzystano w dwóch wariantach jako substrat dla Rhodobacter sphaeroides. Udokumentowano, że używany w badaniach szczep bakterii purpurowych jest zdolny do efektywnej konsumpcji kwasów organicznych uwolnionych ze słomy przez C. uda i L. rhamnosus oraz posiada zdolność do stosunkowo szybkiego wzrostu przy wykorzystaniu tego rodzaju substratów. Wyniki uzyskane z analiz produkcji oraz konsumpcji kwasów organicznych oraz dane dotyczące przeżywalności L. rhamnosus i R. sphaeroides z wykorzystaniem produktów degradacji słomy wskazują na zasadność prowadzenia dalszych badań nad6 zaproponowanym modelem przekształcania celulozy w biopaliwo. Kluczowym etapem w dalszych pracach będzie sprawdzenie, czy przygotowane w taki sposób kwasy organiczne mogą być efektywnie przekształcanie w wodór przez R. sphaeroides.Cellulose is a major component of plant biomass and could be apply inproduction of biofuels, especially bioethanol. To reach this goal cellulolyticmicroorganisms and etanogenic in the next stage are used. The alternative approach is a production of a clean fuel - hydrogen from cellulosic biomass. In this thesis an innovatory model of cellulosic wastes utilization was proposed. It bases on degradation of cellulose by Cellulomonas uda combined with conversion of monosaccharides from cellulosic hydrolyzate by Lactobacillus rhamnosus in order to obtain organic acids. In the next stage organic acids mixture is consumed by the purple bacteria, which are capable of hydrogen production in fotofermentation process using different organic compounds. The aim of this thesis was to verify thepossibility of utilization of cellulose degradation products by Rhodobactersphaeroides. The main methods applied in the research were colorimetric activity assays of cellulases secreted by C. uda as well as HPLC method, serving as a both quantitative and qualitative technique to study organic acids. In the initial step of the studies the methodology of C. uda cultivation was developed, serving to acquire high cellulolyticactivity, which was achieved in two steps of cultivation using two different mediums. Comparing the decomposition of two straws species by C. uda in long term cultivation, information regarding the cellulase activity profile, organic acids concentrations and monosaccharides released from straws were attained. The straw hydrolyzate obtained after degradation by cellulolytic bacteria was used in two variants as a substrate for Rhodobacter sphaeroides. It was documented that the strain of purple bacteria applied in this research can consume effectively organic acids released from straw by C. uda and L. rhamnosus and that is able to growth rapidlywith the presence of these substrates. The obtained results concerning both the organic acids production and consumption as well as the viability of L. rhamnosus and R. sphaeroides cells in medium with straws degradation products show necessity to carry out further research using proposed model of cellulose transformation intobiofuel. The key aim of the further experiments is to confirm whether R. sphaeroides is able to produce hydrogen effectively using the mixture of organic acids originatedfrom cellulose