Evaluación de dos técnicas para la detección molecular de rickettsia asociada a la enfermedad del cogollo arrepollado del papayo en Cuba

El objetivo de este estudio fue optimizar una técnica de diagnóstico para rickettsia-PBT, bacteria asociada a la enfermedad cogollo arrepollado del papayo (PBT), basada en la hibridación de ácidos nucleicos no radiactiva (HANS-PBT), y comparar la factibilidad de su uso con respecto a la PCR convencional. Se optimizó un procedimiento de HANS-PBT que permitió la detección específica de hasta 15 pg de ADN del gen sdhA de rickettsia-PBT. La evaluación de 141 controles caracterizados mediante PCR convencional (PCRPBT), mostró parámetros de desempeño de la HANS-PBT favorables, con una especificidad diagnóstica (ED) de 97,2% y sensibilidad diagnóstica (SD) de 98,5%. Los análisis simultáneos mediante las dos técnicas de 179 muestras colectadas mayormente en plantaciones del occidente de Cuba evidenciaron la presencia de rickettsia- PBT en 118 plantas. Los parámetros de desempeño de la PCR-PBT y HANS-PBT en la evaluación de estas muestras fueron similares, 96% y 98% de ED, 89% y 75% de SD, respectivamente. Aunque la HANS-PBT mostró valores de sensibilidad menores a la PCR-PBT, es factible su uso para programas de mejoramiento genético o prospecciones en estudios epidemiológicos de la diseminación de la bacteria.Palabras clave: cogollo arrepollado del papayo, rickettsia, hibridación, papayo, especificidad, sensibilidad.EVALUATION OF TWO TECHNIQUES FOR THE MOLECULAR DIAGNOSIS OF RICKETTSIA ASSOCIATED TO PAPAYA BUNCHY TOP DISEASE IN CUBAABSTRACT: The aim of this study was to develop a technique based on non radioactive nucleic acid hybridization for the diagnosis of rickettsia-PBT bacterium associated to the papaya bunchy top disease (NASHPBT), and to evaluate its use compared with the conventional PCR. The optimized NASH-PBT method allowed the specific detection of 15 pg of sdhA gen DNA of rickettsia-PBT. The validation parameters in the evaluation of 141 controls previously characterized by PCR evidenced the reliability of the technique, showing diagnosis sensitivity (DS) of 97.2% and diagnosis specificity (DE) of 98.5%. The simultaneous analysis by the NASHPBT and conventional PCR (PCR-PBT) of 179 samples recovered from commercial fields, mostly of the western region of Cuba, evidenced the presence of rickettsia-PBT in 118 plants. The parameters of validations of PCR-PBT and NASH-PBT in the analysis of these samples were 89% and 75% for DS and 96% and 98% for DE, respectively. Despite the lower sensibility value showed respect to NASH-PBT PCR-PBT, its use for genetic improvement programs or surveys in epidemiological studies of this pathogen is realiable.Key words: papaya bunchy top, rickettsia, hybridization, papayo, sensitivity, specificity

Uso del microinjerto in vitro de ápices caulinares para eliminar ´Candidatus Liberibacter asiaticus´ en cultivares de cítricos en Cuba

El objetivo del estudio fue optimizar la técnica de microinjerto in vitro de ápices caulinares (MIV) para eliminar Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) en cultivares de cítricos infectados. Como fuentes de brotes se emplearon plantas de cinco cultivares con síntomas de huanglongbing (HLB): mandarinos Satsuma Tropical y Parson’s Special, los híbridos de mandarinos Sunburst IVIA 200-C-1 y tangelo Nova IVIA 74-7 y limero Persa SRA-58. Para estandarizar el tamaño de ápice, suficiente para la eliminación de CLas, se ensayaron tres dimensiones compuestas por el meristemo apical con 2, 3 y 4 primordios foliares (pf) (0,1 - 0,4 mm). La presencia de CLas se constató mediante PCR dúplex en las plantas sintomáticas y PCR anidada en las plantas obtenidas por MIV. Se alcanzó un prendimiento general de 71,79%, de ellos el 46,15% para ápices de 2 pf y superior al 80% para 3 y 4 pf. De los microinjertos logrados, más del 60% creció y este parámetro estuvo por encima del 40% para ápices de 2 y 3 pf; mientras que el 80,61% correspondió a ápices de 4 pf. El 100% de las plantas obtenidas, a partir de los microinjertos, se mantuvieron libres de CLas por cuatro años, independientemente del tamaño del ápice utilizado. Los resultados confirmaron la efectividad de la técnica de microinjerto in vitro para sanear cultivares de cítricos infectados por CLas.Palabras clave: microinjerto in vitro, saneamiento, huanglongbing, PCR, nPCR.Use of shoot-tip grafting in vitro to eliminate ´Candidatus Liberibacter asiaticus´ in citrus cultivars in CubaABSTRACT: The aim of this research was to optimize the in vitro shoot-tip grafting (STG) technique to eliminate Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) from Citrus infected cultivars. Five citrus cultivars (Satsuma Tropical and Parson’s Special mandarins, Sunburst IVIA 200-C-1 and Nova IVIA 74-7 hybrids of mandarins and Persian SRA-58 lime) showing symptoms of huanglongbing (HLB) were used as bud source:. Three different apex sizes, composed of the apical meristem with two, three and four leaf primordia (lp) (0.1 - 0.4 mm), were tested to standardize the apex size required to eliminate CLas. The presence of the pathogen was verified by the conventional PCR in the symptomatic plants and the nested PCR in the asymptomatic ones. The final success percentage of the shoot-tip grafting was 71.79%; 46.15% for the apex with 2 lp and over 80% for apexes with 3 and 4 lp. Sixty per cent of all the shoot-tip grafting grew normally, and this parameter was over 40% when apexes with 2 and 3 lpwere used, whereas it reached 80.61% when the apex with 4 lp was used. The 100% of the shoot-tip grafted plants were diagnosed as CLas free and this status was kept for four years regardless the shoot-tip size used. The results confirmed the reliability of the STG for removing CLas from citrus infected cultivars.Key words: shoot-tip grafting, sanitation, huanglongbing, PCR, nPCR

Uso del microinjerto in vitro de ápices caulinares para eliminar ´Candidatus Liberibacter asiaticus´ en cultivares de cítricos en Cuba

El objetivo del estudio fue optimizar la técnica de microinjerto in vitro de ápices caulinares (MIV) para eliminar Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) en cultivares de cítricos infectados. Como fuentes de brotes se emplearon plantas de cinco cultivares con síntomas de huanglongbing (HLB): mandarinos Satsuma Tropical y Parson’s Special, los híbridos de mandarinos Sunburst IVIA 200-C-1 y tangelo Nova IVIA 74-7 y limero Persa SRA-58. Para estandarizar el tamaño de ápice, suficiente para la eliminación de CLas, se ensayaron tres dimensiones compuestas por el meristemo apical con 2, 3 y 4 primordios foliares (pf) (0,1 - 0,4 mm). La presencia de CLas se constató mediante PCR dúplex en las plantas sintomáticas y PCR anidada en las plantas obtenidas por MIV. Se alcanzó un prendimiento general de 71,79%, de ellos el 46,15% para ápices de 2 pf y superior al 80% para 3 y 4 pf. De los microinjertos logrados, más del 60% creció y este parámetro estuvo por encima del 40% para ápices de 2 y 3 pf; mientras que el 80,61% correspondió a ápices de 4 pf. El 100% de las plantas obtenidas, a partir de los microinjertos, se mantuvieron libres de CLas por cuatro años, independientemente del tamaño del ápice utilizado. Los resultados confirmaron la efectividad de la técnica de microinjerto in vitro para sanear cultivares de cítricos infectados por CLas.Palabras clave: microinjerto in vitro, saneamiento, huanglongbing, PCR, nPCR.Use of shoot-tip grafting in vitro to eliminate ´Candidatus Liberibacter asiaticus´ in citrus cultivars in CubaABSTRACT: The aim of this research was to optimize the in vitro shoot-tip grafting (STG) technique to eliminate Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) from Citrus infected cultivars. Five citrus cultivars (Satsuma Tropical and Parson’s Special mandarins, Sunburst IVIA 200-C-1 and Nova IVIA 74-7 hybrids of mandarins and Persian SRA-58 lime) showing symptoms of huanglongbing (HLB) were used as bud source:. Three different apex sizes, composed of the apical meristem with two, three and four leaf primordia (lp) (0.1 - 0.4 mm), were tested to standardize the apex size required to eliminate CLas. The presence of the pathogen was verified by the conventional PCR in the symptomatic plants and the nested PCR in the asymptomatic ones. The final success percentage of the shoot-tip grafting was 71.79%; 46.15% for the apex with 2 lp and over 80% for apexes with 3 and 4 lp. Sixty per cent of all the shoot-tip grafting grew normally, and this parameter was over 40% when apexes with 2 and 3 lpwere used, whereas it reached 80.61% when the apex with 4 lp was used. The 100% of the shoot-tip grafted plants were diagnosed as CLas free and this status was kept for four years regardless the shoot-tip size used. The results confirmed the reliability of the STG for removing CLas from citrus infected cultivars.Key words: shoot-tip grafting, sanitation, huanglongbing, PCR, nPCR

Incidencia de Citrus tristeza virus (CTV) en áreas citrícolas de Cuba y caracterización parcial de aislados virales. [Incidence of Citrus tristeza virus (CTV) in citrus areas of Cuba and partial characterization of viral isolates.]. FVTO-20.

RESUMEN.Citrus tristeza virus (CTV) es el patógeno de origen viral que causa más pérdidas económicas al cultivo de los cítricos. En Cuba, los cambios tecnológicos introducidos en la citricultura como consecuencia de la detección de huanglongbing de los cítricos (HLB), pudieran influir sobre la incidencia de la enfermedad y la composición de los genotipos en las poblaciones de aislados del virus.ABSTRACT.Citrus tristeza virus (CTV) is the pathogen of viral origin that causes more economic losses to the cultivation of citrus. In Cuba, the technological changes introduced in citriculture as a consequence of the detection of citrus huanglongbing (HLB), could influence the disease incidence and the genotypes composition in populations of virus isolates