Спектроскопическое исследование метиленового синего in vivo: влияние на оксигенацию тканей и опухолевый метаболизм

Methylene blue (MB) is a promising photosensitizer (PS) for the treatment of pathological neoplasms, since it has both photodynamic activity (under laser irradiation) and redox and catalytic properties (in the absence of light). In the framework of this work, using spectroscopic methods, the effect of intravenous administration of MB on tissue oxygenation of hemoglobin in small animals in vivo in tumor and normal tissues was analyzed. The influence of MB on cell metabolism was analyzed. It has been shown that the use of MB promotes an increase in oxygen consumption by the tumor, and also leads to a shift in metabolism towards oxidative phosphorylation. It was shown that the use of MB contributes to an increase in oxygen consumption by the tumor, and also leads to a shift in metabolism towards oxidative phosphorylation.Метиленовый синий (МС) является перспективным фотосенсибилизатором для терапии патологических новообразований, поскольку обладает как фотодинамической активностью (при лазерном облучении), так и окислительно-восстановительными и каталитическими свойствами (в отсутствии света). В рамках данной работы при помощи спектроскопических методов было проанализировано влияние внутривенного введения МС на тканевую оксигенацию гемоглобина на малых животных in vivo в опухоли и нормальных тканях. Проведен анализ влияния МС на клеточный метаболизм. Показано, что применение МС способствует увеличению потребления кислорода опухолью, а также приводит к сдвигу метаболизма в сторону окислительного фосфорилирования

Visualization of Nd3+-doped Laf3 Nanoparticles For Near Infrared Bioimaging via Upconversion Luminescence at Multiphoton Excitation Microscopyvisualization of Nd3+-doped Laf3 Nanoparticles For Near Infrared Bioimaging via Upconversion Luminescence at Multiphoton Excitation Microscopy

Recent developments in the field of biophotonics facilitate the raise of interest to inorganic nanoparticles (NPs) doped with Nd 3+ ions, because of their near-infrared (NIR) absorption. These NPs are interesting bioimaging probes for deep tissue visualization, while they can also act as local thermometers in biological tissues. Despite the good possibilities for visualization of NPs with Nd 3+ ions in NIR spectral range, difficulties arise when studying the cellular uptake of these NPs using commercially available fluorescence microscopy systems, since the selection of suitable luminescence detectors is limited. However, Nd 3+ ions are able to convert NIR radiation into visible light, showing upconversion properties. In this paper we found optimal parameters to excite upconversion luminescence of Nd 3+ :LaF 3 NPs in living cells and to compare the distribution of the NPs inside the cell culture of human macrophages THP-1 obtained by two methods. Firstly, by detecting the upconversion luminescence of the NPs in VIS under NIR multiphoton excitation using laser scanning confocal microscopy and secondly, using transmission electron microscopy

Спектроскопическое исследование фотофизических свойств метиленового синего в биологических средах

A spectroscopic study of the photophysical properties of methylene blue (MB) in aqueous solutions was carried out. Absorption and fluorescence spectra as well as fluorescence lifetime were recorded. The concentration dependence of the intensity and shape of the spectra allowed establishing the ranges of MB concentrations for in vitro and in vivo studies at which aggregation is not observed (up to 0.01 mM, which corresponds to 3.2 mg/kg). Studies of photodegradation in biological media showed that photobleaching of more than 80% in plasma and culture media is observed already at a dose of 5 J/cm2 , while in water at this concentration and dose photobleaching is not yet observed, and at a dose of 50 J/cm2  photobleaching of MB is about 30%. It was found that in media containing proteins and having an alkaline pH, photobleaching occurs significantly faster than in neutral aqueous media. The ionic strength of the solution has no effect on the photobleaching rate. Such photobleaching is caused by the photodegradation of MB rather than the transition to the leucoform.The efficiency of singlet oxygen generation and photodynamic activity were evaluated in vitro. In the investigated range of MB concentrations, the efficiency of singlet oxygen generation is rather low, because positively charged MB binds to negatively charged cell membranes, which leads to a change in the type of photodynamic reaction. The emergence of other reactive oxygen species (ROS), different from singlet oxygen, in cells has been demonstrated. The generation of ROS and the low quantum yield of singlet oxygen generation indicate the tendency of MB to provide the type I photosensitization mechanism (electron transfer with the formation of semi-reduced and semi-oxidized MB+ radicals) rather than to the type II mechanism (energy transfer to oxygen with the formation of singlet oxygen) in biological media and in vivo.Проведено спектроскопическое исследование фотофизических свойств метиленового синего (МС) в водных растворах и биологических жидкостях. Зарегистрированы спектры поглощения и флуоресценции, а также времена жизни флуоресценции. По зависимости интенсивности и формы спектров от концентрации удалось установить диапазоны концентраций МС для исследований in vitro и in vivo при которых не наблюдается агрегация (до 0,01 мМ, что соответствует 3,2 мг/кг). Исследовано фотообесцвечивание МС под действием лазерного излучения. Исследования фотодеградации в биологических средах показали, что фотообесцвечивание более чем на 80% в плазме и культуральной среде наблюдается уже при дозе 5 Дж/см2 , в то время как в воде при такой концентрации при дозе 5 Дж/см2  фотообесцвечивания еще не наблюдается, а при дозе 50 Дж/см2  фотообесцвечивание МС составляет порядка 30%. Установлено, что в средах, содержащих белки и обладающих щелочным рН, фотообесцвечивание происходит существенно быстрее, чем в нейтральных водных средах. Ионная сила раствора не оказывает влияния на скорость фотообесцвечивания. Такое фотообесцвечивание вызвано фотодеградацией МС, а не переходом в лейкоформу. Проведена оценка эффективности генерации синглетного кислорода и фотодинамической активности in vitro. В исследуемом диапазоне концентраций МС эффективность генерации синглетного кислорода достаточно низкая, так как положительно заряженный МС связывается с негативно заряженными мембранами клеток, что приводит к изменению типа фотодинамической реакции. Продемонстрировано возникновение в клетках других активных форм кислорода (АФК), отличных от синглетного кислорода. Генерация АФК и невысокий квантовом выход генерации синглетного кислорода свидетельствуют о склонности МС к механизму фотосенсибилизации I типа (перенос электрона с образованием полувосстановленных и полуокисленных радикалов MB+), а не к механизму II типа (перенос энергии к кислороду с образованием синглетного кислорода) в биологических средах и in vivo

Фотоиндуцированные процессы наночастиц оксида железа для усиления лазерной терапии

Nanoparticles are used as drug carriers to increase the selectivity and effectiveness of therapy, as well as for combined therapy that utilizes different effects. Iron oxide nanoparticles are promising in this aspect. Due to magnetic properties, they can be used as a contrast agent for magnetic resonance imaging. Also, iron oxide nanoparticles could be coated with a photosensitizer for photodynamic therapy and their laser or magnetic heating can be used for phototherapy. Local enhancement of the electromagnetic field near iron oxide nanoparticles can increase the fluorescence intensity of photosensitizers and the efficiency of singlet oxygen generation. This paper presents the results of a study of iron oxide nanoparticles focused on the photophysical aspects of the formation of “hot spots” under laser irradiation. The photoinduced effects of iron oxide nanoparticles observed in in vitro experiments lead to the rupture of lysosomes. Theoretical modeling showed that the heating of iron oxide nanoparticles with a radius of 35 nm under the action of laser radiation is about 89°C and 19°C for wavelengths of 458 and 561 nm, respectively. Local field enhancement occurs in pairs of nanoparticles of various sizes and strongly depends on the distance between them. The maximum gain is achieved at small distances between nanoparticles. For a dimer of nanoparticles with radii of 10 and 35 nm at a distance of 1 nm, an enhancement factor of two orders of magnitude was obtained. The investigated phenomenon of «hot spots» is in demand for precision therapy, because the photo-induced processes occur at small distances between nanoparticles, in areas of their high accumulation.Наночастицы используются в качестве носителей лекарственных средств для повышения селективности и эффективности терапии, а также для сочетанной терапии, объединяющей разные виды воздействия. Перспективными в этом аспекте являются наночастицы оксида железа. Благодаря магнитным свойствам, они могут быть применяться в качестве контраста для магнитно-резонансной томографии. Также наночастицы оксида железа могут быть покрыты фотосенсибилизатором для фотодинамической терапии, а их лазерный или магнитный нагрев этих частиц может используется для проведения фототерапии. При этом локальное усиление электромагнитного поля вблизи наночастиц оксида железа может повысить интенсивность флуоресценции фотосенсибилизаторов и эффективность генерации синглетного кислорода.В работе представлены результаты исследования наночастиц оксида железа, сфокусированного на фотофизических аспектах образования «горячих точек» при лазерном облучении. Фотоиндуцированные эффекты наночастиц оксида железа, наблюдаемые в экспериментах in vitro, приводят к разрыву лизосом. Теоретическое моделирование показало, что нагрев наночастиц оксида железа радиусом 35 нм под действием лазерного излучения составляет порядка 89˚С и 19˚С для длин волн 458 и 561 нм, соответственно. Локальное усиление поля возникает в парах из наночастиц различного размера и сильно зависит от расстояния между ними. Максимальное усиление достигается при малых расстояниях между наночастицами. Для димера наночастиц с радиусами 10 нм и 35 нм на расстоянии 1 нм получен фактор усиления на два порядка. Рассмотренное явление «горячих точек» востребовано для прецизионной терапии, так как фотоиндуцированные процессы возникают на малых расстояниях между наночастицами, в областях с их высоким накоплением

ВИЗУАЛИЗАЦИЯ НАНОЧАСТИЦ LaF3, ДОПИРОВАННЫХ Nd3+, ДЛЯ БИОИМИДЖИНГА В БЛИЖНЕМ ИНФРАКРАСНОМ ДИАПАЗОНЕ ПО АП-КОНВЕРСИОННОЙ ЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ ПРИ МИКРОСКОПИИ С МУЛЬТИФОТОННЫМ ВОЗБУЖДЕНИЕМ

Recent developments in the field of biophotonics facilitate the raise of interest to inorganic nanoparticles (NPs) doped with Nd3+ ions, because of their near-infrared (NIR) absorption. These NPs are interesting bioimaging probes for deep tissue visualization, while they can also act as local thermometers in biological tissues. Despite the good possibilities for visualization of NPs with Nd3+ ions in NIR spectral range, difficulties arise when studying the cellular uptake of these NPs using commercially available fluorescence microscopy systems, since the selection of suitable luminescence detectors is limited. However, Nd3+ ions are able to convert NIR radiation into visible light, showing upconversion properties. In this paper we found optimal parameters to excite upconversion luminescence of Nd3++:LaF NPs in living cells and to compare the distribution of the NPs inside the cell culture of human macrophages THP-1 obtained by two methods. Firstly, by detecting the upconversion luminescence of the NPs inVIS under NIR multiphoton excitation using laser scanning confocal microscopy and secondly, using transmission electron microscopy.Последние разработки в области биофотоники способствуют повышению интереса к неорганическим наночастицам (НЧ), допированным ионами Nd3+, из-за их поглощения в ближнем инфракрасном (БИК) спектральном диапазоне. Эти НЧ являются перспективными зондами для глубокой визуализации тканей, в то же время они могут служить локальными термометрами в биологических тканях. Несмотря на хорошие возможности визуализации НЧ с ионами Nd3+ в БИК спектральном диапазоне, при изучении внутриклеточного распределения этих НЧ с использованием коммерчески доступных флуоресцентных микроскопических систем возникают трудности из-за ограниченности выбора подходящих детекторов люминесценции. Однако, ионы Nd3+ способны преобразовывать БИК излучение в видимый свет, демонстрируя ап-конверсионные свойства. В этой работе мы определили оптимальные параметры для возбуждения ап-конверсионной люминесценции НЧ Nd3+: LaF в живых клетках и сравнили распределение НЧ внутри клеток культуры человеческих макрофагов THP-1, полученное двумя методами. Во-первых, путем регистрации ап-конверсионной люминесценции НЧ в видимом диапазоне при многофотонном возбуждении в БИК диапазоне спектра с использованием лазерной сканирующей конфокальной микроскопии и, во-вторых, с использованием просвечивающей электронной микроскопии

Исследование кинетики затухания фотолюминесценции молекулярных нанокристаллов фталоцианина алюминия при взаимодействии с иммунокомпетентными клетками

This work is dedicated to the study of the photoluminescence kinetics of aluminum phthalocyanine nanoparticles in colloidal solutions at different pH and in the interaction with immune cells (macrophages). For measurements we used a registration system based on Hamamatsu streak camera (C10627-13 Hamamatsu Photonics) with picosecond temporal resolution (15 ps), conjugated with the fiberoptic spectrometer and picosecond laser pumping. The changes in fluorescence decay kinetics as additional lifetime components of fluorescence were found during the experiment. The number of components and duration of lifetimes changed while interacting with cells and depends on pH. At pH 2 the presence of two fluorescence lifetimes was recorded: the first one was 5 ns, which corresponded to the molecular form in solution, and 1.5 ns, which corresponded to bound state of phthalocyanine molecules. Due to the absence of other possible objects for bounding in the solution except of the nanoparticles we can suggest with a high degree of accuracy that the bounding occurs with the very these nanoparticles. Analysis of the fluorescence lifetimes of aluminum phthalocyanine nanoparticles in macrophages indicated the presence of two components: 9 ns and 4.5 ns. A model of surface molecules transitions from parallel to perpendicular position, regarding to the plane of the crystal nanoparticle was proposed.Работа посвящена исследованию кинетики фотолюминесценции коллоидных растворов молекулярных нанокристаллов фталоцианина алюминия при различных pH и при взаимодействии с иммунокомпетентными клетками (макрофагами). Изучение кинетики проводилось при помощи системы регистрации, основанной на стрик-камере с пикосекундным разрешением (до 15 пс) C10627-13 Hamamatsu Photonics, сопряженной с волоконно-оптическим спектрометром, при пикосекундном лазерном возбуждении. В ходе эксперимента было зафиксировано изменение кинетики затухания флуоресценции, выраженное в появлении дополнительных компонент времен жизни флуоресценции. Количество компонент и длительность времени жизни изменялись при взаимодействии с клетками и в зависимости от pH. Так, при pH 2 было зафиксировано наличие двух времён жизни флуоресценции: 5 нс, что соответствует молекулярной форме в растворе, и 1,5 нс, что соответствует связанному состоянию молекулы фталоцианина. Так как кроме наночастиц в растворе других возможных объектов связывания нет, то, с большой степенью достоверности, можно предположить, что связывание происходит именно с наночастицами. Исследование времени жизни флуоресценции наночастиц фталоцианина алюминия в макрофагах показало наличие двух компонент порядка 9 нс и 4,5 нс. Была предложена модель перехода поверхностных молекул фталоцианина алюминия из пара- в ортоположение относительно поверхности кристаллической наночастицы

РАЗРАБОТКА И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ НЕЙРОПОРТА ДЛЯ ТЕРАПИИ ГЛИОМЫ ГОЛОВНОГО МОЗГА

Current paper presents the results of the system development for intracranial implantation aimed on therapy and prevention of brain gliomas relapse. The main property of the system, in prospective,  will be to direct the growth of glioma cells localized in the region  adjacent to the site of the removed tumor along the fi bers towards  the proximal part of the fiber-optic scaffold (neuroport). Such  approach will allow carrying out cells diagnostics by the  photoluminescence signal and provide subsequent destruction of  malignant cells by photodynamic action. Besides, this system could  be used for monitoring the processes occurring in the probed area in order to control the possible relapses. The localization of cells along  the fi ber structures covered with gelatin compound, which is the  source of amino acids during cultivation, was shown during the glioma cells growth dynamics study. Moreover, four different designs of intracranial scaffold models, serving as ports for diagnostic and therapeutic laser radiation delivery, were developed and  successfully tested in the framework of the research. The results  obtained on the rats brain with induced tumors (glioma C6) after  neuroport implantation demonstrate sufficiently intense fluorescence in the tumor bed after intravenous injection of the  nonmetallic sulfonated phthalocyanine based photosensitizer, and a  pronounced photodynamic effect leading to total destruction of the  tumor. In this way, the results of this study open the prospects of creating the neuroport with an internal fi ber structure that focuses the glioma cells growth.В работе представлены результаты разработки системы для внутричерепной имплантации с целью терапии и предотвращения рецидивирования глиом головного. Основное свойство  системы в перспективе будет состоять в том, чтобы направить рост клеток глиомы,  локализованных в области, прилегающей к месту удаленной опухоли, вдоль волокон по  направлению к проксимальной части волоконно-оптического имплантата (нейропорт) с  целью их регистрации по сигналу фотолюминесценции и последующей их деструкции в  результате фотодинамического воздействия. Такое устройство должно обеспечить  мониторинг процессов, происходящих в зондируемой области с целью контроля процессов  рецидивирования. В ходе данного исследования динамики роста клеток глиомы показана  локализация клеток вдоль волоконных структур, покрытых желатином, который является  источником аминокислот при культивировании. Также в ходе работы были разработаны и  успешно апробированы четыре различных конструкции макетов внутричерепных  имплантатов, выполняющие роль портов для доставки диагностического и терапевтического лазерного излучения. Получены на головном мозге крыс с индуцированными опухолями  (глиома С6) после имплантации нейропорта, демонстрирующие достаточно интенсивную  флуоресценцию в ложе опухоли при внутривенном введении фотосенсибилизатора на  основе безметального сульфированного фталоцианина и выраженный фотодинамический  эффект, приведший к тотальному разрушению опухоли. Полученные результаты открывают  перспективы создания нейропорта с внутренней волоконной структурой, фокусирующей рост клеток глиомы

МЕТОДЫ ФОТОНИКИ ДЛЯ ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА ПРИЖИВЛЕНИЯ КОЖНЫХ ТРАНСПЛАНТАТОВ

 In this review, based on more than 70 articles of Russian and foreign authors, methods of skin engraftment monitoring are discussed. Main processes occurring in skin on cellular and subcellular levels at different stages of engraftment are considered. Optical methods which allow performing non-invasive analysis of blood vessels, collagen concentration and form of cellular respiration (by NADH fluorescence) are described. Comparative analysis of nuclear and optical methods for engraftment monitoring highly developed and widespread nowadays is presented. The advantages of optical methods includes multifunctionality, usability and clarity of results, safety and low cost. In contrast to X-ray CT, MRI and ultrasound, optical methods can be used in monitoring mode. One of the promising directions for improving quality of engraftment due to antibacterial effect, photodynamic therapy, is described in details. The use of crystalline organic nanophotosensitizers (particularly aluminum phthalocyanine) is shown to be the most promising. The main distinctive feature of its application is that nanoparticles injected into wound surface or contact area of tissue graft are not photoactive until the moment the inflammation starts. The development of method for assessing skin condition by spectroscopic properties of tissue components (using fluorescent dyes and photosensitizers in molecular and nanoforms), which allows analyzing physiological state of skin (degree and rate of engraftment or rejection) and controlling certain biochemical and physiological parameters of a tissue graft or an entire area of affected skin is shown to be crucial.Настоящий обзор, основанный более чем на 70 проанализированных статьях российских и зарубежных авторов, посвящен методам мониторинга состояния трансплантируемых участков кожи. В обзоре рассмотрены основные процессы, происходящие в коже на клеточном и субклеточном уровнях на разных этапах приживления трансплантата. Описаны оптические методы, позволяющие проводить неинвазивный анализ состояния кровеносных сосудов, концентрации коллагена, типа клеточного дыхания (по флуоресценции NADH). Приведена сравнительная таблица ядерных и оптических методов мониторинга состояния приживления трансплантата, наиболее широко развитых и использующихся на сегодняшний день. Отмечено, что преимущество оптических методов заключается в многофункциональности, простоте использования и интерпретации результатов, безопасности, низкой стоимости, а также в возможности использования в режиме мониторинга, в отличие от рентгено-компьютерной томографии, МРТ и УЗИ. Подробно рассмотрено одно из перспективных направлений, используемых для улучшения качества приживления трансплантатов преимущественно за счет антимикробного эффекта – фотодинамическая терапия. Отмечено, что перспективным является использование для фотодинамической терапии кристаллических наночастиц органических фотосенсибилизаторов, в частности фталоцианина алюминия. Основная отличительная особенность их использования заключается в том, что наночастицы, введенные в область раневой поверхности или в контактную область приживляемой ткани или трансплантата, не проявляют фотоактивности до момента начала воспаления. Сделан вывод, что актуальной является задача по разработке метода оценки состояния кожного покрова по спектроскопическим свойствам компонентов тканей (с использованием флуоресцентных красителей и фотосенсибилизаторов в молекулярной и наноформах), который позволит анализировать физиологическое состояние кожного покрова (степень и скорость приживления или отторжения), а также контролировать некоторые биохимические и физиологические параметры трансплантата или всей области поражения кожи

НЕИНВАЗИВНАЯ ОЦЕНКА ЛОКАЛЬНОЙ ТЕМПЕРАТУРЫ НАГРЕВА БИОТКАНЕЙ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ ПО СПЕКТРАМ ЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ ИОНОВ Nd3+

Laser hyperthermia is one of the promising methods for treatment of oncological diseases. For routine clinical use of hyperthermia, it is necessary to control the uniformity and localization of heat within the tumor. Local heating can be achieved by using special thermal agents, such as nanoparticles doped with rare-earth ions. Measurement of the temperature of the thermal agents will allow timely regulation of the applied laser radiation excitation power and optimization of the hyperthermia process.The paper presents the results of a study on the non-invasive determination of the YPO4 nanoparticles doped with Nd3+ temperature with sensitivity of 0.2% °С-1 in 30-60°С temperature range. The temperature of the nanoparticles was calculated from the Nd3+ luminescence spectra in the 800-1000 nm range under excitation into 4F5/2 energy state by 805 nm laser. A calibration procedure for recalculating the ratio of the luminescence intensities from the Stark sublevels of the 4F3/2 Nd3+ state into the values of the real NP temperature in accordance with the Boltzmann distribution is given. An algorithm for calculating luminescence intensities for individual Stark components is proposed. After calculating the intensities corresponding to each individual Stark component, all the intensities related to the transition from the upper and lower Stark sublevels of the 4F3/2 state are summed, and then their ratio is calculated. The resulting ratio is normalized to the value of the ratio at room temperature and, in accordance with the calibration dependence, is recalculated into the NP heating temperature. It was demonstrated that the investigated 1%Nd3+:YPO4 nanoparticles can be used as "primary” thermometers that do not require additional recalibration to evaluate the temperature in the range used for hyperthermia.Одним из перспективных методов лечения онкологических заболеваний является метод лазерной гипертермии. Для рутинного клинического использования гипертермии необходимо контролировать однородность и локальность нагрева внутри опухоли. Добиться локального нагрева можно при использовании специальных термоагентов, в качестве которых могут выступать наночастицы (НЧ), допированные редкоземельными ионами. Измерение температуры термоагентов в режиме реального времени позволит своевременно регулировать подаваемую возбуждающую мощность лазерного излучения и оптимизировать режимы гипертермии.В работе представлены результаты исследования по неинвазивному определению температуры НЧ YPO4, допированных ионами Nd3+, c чувствительностью 0,2% °С-1 в диапазоне температур 30-60°С. Температура НЧ рассчитывалась по спектрам люминесценции Nd3+ в диапазоне 800-1000 нм при возбуждении на уровень 4F5/2 лазерным излучением 805 нм. Приведена процедура калибровки для пересчета отношения интенсивностей люминесценции со штарковских подуровней состояния 4F3/2 Nd3+ в значения реальной температуры НЧ в соответствии с распределением Больцмана. Предложен алгоритм расчета интенсивностей люминесценции для отдельных штарковских компонент. После вычисления интенсивностей, соответствующих каждой отдельной штарковской компоненте, происходит суммирование всех интенсивностей, относящихся к переходу с верхнего и с нижнего штарковских подуровней состояния 4F3/2, а затем вычисляется их отношение. Полученное отношение нормируется на значение отношения при комнатной температуре и в соответствии с калибровочной зависимостью пересчитывается в температуру нагрева НЧ. Продемонстрировано, что исследуемые НЧ Nd3+:YPO4 могут быть использованы в качестве так называемых «первичных» термометров, не требующих дополнительной перекалибровки для оценки температуры в диапазоне температур, используемом при гипертермии