Novel dendritic multifunctional nanocarriers and their application in biomedicine

En el marco de las posibilidades ofrecidas por la nanotecnología, los materiales dendríticos presentan un gran interés debido a su gran potencial como transportadores de moléculas de diversa naturaleza. En este sentido, los dendrímeros y materiales derivados han sido ampliamente utilizados en biomedicina como transportadores de fármacos y de material genético. Dentro de la gran variedad de dendrímeros existente, la presente tesis doctoral se ha centrado en el estudio de materiales dendríticos basados en el ácido 2,2´-bis(hidroximetil)propiónico (bis-MPA) y el ácido 2,2’-bis(gliciloximetil)propiónico (bis-GMPA). Éste último incluye grupos amida internos potencialmente capaces de establecer puentes de hidrógeno con las moléculas que aloje en su interior y reforzar de esta manera su interacción para una encapsulación más eficiente. Basados en estas unidades mínimas, se han diseñado dos tipos de materiales dendríticos: dendrímeros de tipo Jano anfífilos y polímeros hiperramificados dendronizados (DHPs, por sus siglas en inglés). Los dendrímeros tipo Jano anfífilos combinan una cara hidrófila con una lipófila y en esta tesis doctoral, se ha alternado la composición bis-MPA/ bis-GMPA entre ambas caras. Además, también se ha modificado el número de cadenas lipófilas (2 ó 4), alterando de esta manera el balance hidrófilo del dendrímero resultante. En concreto, los dendrímeros Jano sintetizados han sido:- (NH3+)8[GMPA]-[MPA](C17)2 que consiste en un dendrón hidrófilo de bis-GMPA 3ª generación y un dendrón lipófilo de bis-MPA de 1ª generación,- (NH3+)8[GMPA]-[MPA](C17)4 que consiste en un dendrón hidrófilo de bis-GMPA 3ª generación y un dendrón lipófilo de bis-MPA de 2ª generación,- (NH3+)8[MPA]-[GMPA](C17)2 que consiste en un dendrón hidrófilo de bis-MPA 3ª generación y un dendrón lipófilo de bis-GMPA de 1ª generación,- (NH3+)8[MPA]-[GMPA](C17)4 que consiste en un dendrón hidrófilo de bis-MPA 3ª generación y un dendrón lipófilo de bis-GMPA de 2ª generación.Por otra parte, los DHPs sintetizados consisten en un núcleo hiperramificado de bis-MPA de diferentes generaciones (G2, G3 o G4) en el cual se han insertado dendrones de bis-MPA o de bis-GMPA, obteniendo en ambos casos macromoléculas globulares policatiónicas. Esta última característica es de gran interés para acomplejar electrostáticamente diversas moléculas de naturaleza aniónica. Específicamente, se han sintetizado seis DHPs que se pueden clasificar de la siguiente manera según los dendrones componentes:Serie bis-MPA:- DHP(G2)-MPA que consiste en un núcleo hiperramificado de 2ª generación rodeado de dendrones de bis-MPA, con un total de 64 grupos amino terminales teóricos,- DHP(G3)-MPA que consiste en un núcleo hiperramificado de 3ª generación rodeado de dendrones de bis-MPA, con un total de 128 grupos amino terminales teóricos,- DHP(G4)-MPA que consiste en un núcleo hiperramificado de 4ª generación rodeado de dendrones de bis-MPA, con un total de 256 grupos amino terminales teóricos.Serie bis-GMPA:- DHP(G2)-GMPA que consiste en un núcleo hiperramificado de 2ª generación rodeado de dendrones de bis-GMPA, con un total de 64 grupos amino terminales teóricos,- DHP(G3)-GMPA que consiste en un núcleo hiperramificado de 3ª generación rodeado de dendrones de bis-GMPA, con un total de 128 grupos amino terminales teóricos,- DHP(G4)-GMPA que consiste en un núcleo hiperramificado de 4ª generación rodeado de dendrones de bis-GMPA, con un total de 256 grupos amino terminales teóricos.En todos los casos, la estrategia empleada para la unión de los dendrones entre sí o la unión de los dendrones al núcleo hiperramificado ha sido la reacción de cicloadición 1,3-dipolar entre grupos azida y alquino catalizada por Cu (I), CuAAC, dando lugar a un anillo de triazol.Tras sintetizar, caracterizar y estudiar las propiedades de ambos tipos de materiales dendríticos en medio acuoso (capítulo 2), se ha realizado un estudio más específico de los dendrímeros tipo Jano como transportadores de fármacos anti-hepatitis C (capítulo 3) y anti-tuberculosos (capítulo 4); mientras que los DHPs se han explorado como vectores de heparina en el tratamiento de la malaria (capítulo 5) y como vectores de material genético dentro de la estrategia denominada transfección génica (capítulo 6).El estudio de la hepatitis C se ha focalizado en rescatar la actividad antiviral de dos compuestos que inhiben la actividad de la proteasa viral NS3 in vitro, pero que presentan escasa actividad en estudios celulares. Estos compuestos son el ácido iopanoico (IA) y el tiratricol (TRIAC), y ambos se han solubilizado con la ayuda de dendrímeros Jano como nanotransportadores. Inicialmente, se ha realizado un estudio calorimétrico para evaluar la interacción entre los compuestos y los agregados dendríticos, y posteriormente, se han incorporado dichos compuestos mediante difusión en los agregados dendríticos previamente formados. Estos agregados cargados con los compuestos se han caracterizado morfológicamente y se ha evaluado su actividad antiviral al mismo tiempo que se ha estudiado su efecto citotóxico sobre las células. Los dendrímeros más prometedores para esta aplicación han sido (NH3+)8[GMPA]-[MPA](C17)2 y (NH3+)8[GMPA]-[MPA](C17)4, consiguiendo reducir considerablemente la EC40 de los fármacos libres.En cuanto a la tuberculosis, el carácter anfífilo de los dendrímeros Jano se ha aprovechado para encapsular fármacos de diferente naturaleza de manera individual (rifampicina (RIF), isoniazida (INH), estreptomicina o bedaquilina) y combinaciones de ellos (RIF+INH). Los agregados resultantes se han caracterizado y la cantidad de fármaco encapsulada se ha cuantificado mediante HPLC. Adicionalmente, se ha evaluado la actividad antimicrobiana de todos los fármacos libres y encapsulados individualmente en los cuatro dendrímeros Jano frente a M. bovis BCG, comprobando que se mantiene de manera generalizada la actividad de los fármacos tras su encapsulación excepto en el caso de la bedaquilina. Posteriormente y tras comprobar la ausencia de sinergismo entre RIF e INH libres, se ha seleccionado el dendrímero (NH3+)8[GMPA]-[MPA](C17)4 para realizar la co-encapsulación de ambos (RIF+INH), y tras la correspondiente caracterización de los nanoagregados resultantes, se ha explorado su actividad antimicrobiana frente a diferentes cepas (M. bovis BCG, M. tuberculosis y Mtb-THP1). Otro estudio interesante realizado ha consistido en la evaluación de la cinética de muerte de Mtb con el tiempo frente a las diferentes combinaciones de fármacos libres y encapsulados en el dendrímero, lo que permite visualizar la aparición de resistencias bacterianas. En este sentido, ciertas condiciones de fármacos encapsulados han permitido retrasar la aparición de resistencias bacterianas, lo cual es muy positivo e interesante de cara a posibles estudios in vivo.El estudio sobre la malaria se ha centrado en mejorar las propiedades ventajosas del polisacárido heparina como agente antimalárico y como molécula de direccionamiento hacia glóbulos rojos infectados por el parásito. Para ello, se han empleado los DHPs como vectores capaces de acomplejar la heparina y potencialmente capaces de reducir los efectos laterales perjudiciales del tratamiento con el polisacárido (fuerte actividad anticoagulante que puede derivar en hemorragias cerebrales, escaso tiempo de circulación en sangre, etc.). En primer lugar, se han formado los complejos DHP/heparina mediante interacciones electrostáticas y se han caracterizado morfológicamente. A continuación, se ha estudiado la cinética de liberación de la heparina de los complejos, observando un posible efecto de las amidas del bis-GMPA como grupos capaces de establecer puentes de hidrógeno y retener en mayor medida el polisacárido. La actividad antiparasitaria de todos los complejos DHP/heparina formados, así como la de los complejos entre la heparina y los DHPs marcados con el fluoróforo rodamina (DHP-Rh/heparina), ha revelado buenos niveles de actividad de la heparina acomplejada, mejorando la IC50 de la heparina libre en algunos casos. Además, se ha estudiado mediante distintas técnicas el direccionamiento preferencial de los complejos DHPs-Rh/heparina frente a glóbulos rojos sanos o infectados por el parásito. Por último, se ha estudiado el tiempo de circulación en plasma de la heparina libre y formando complejos con los DHPs en un modelo animal in vivo.Los DHPs también se han explorado como vectores no virales para introducir material genético en células tumorales (HeLa) y mesenquimales (mMSCs); es decir, para la aplicación denominada transfección génica. En primer lugar, se han establecido los ratios N/P a los cuales se forman los dendriplejos (complejos entre dendrímero y material genético) con pDNA y siRNA. Tras caracterizar los dendriplejos mediante diversas técnicas fisico-químicas, se ha evaluado su actividad como vectores génicos en las correspondientes líneas celulares, empleando la proteína verde fluorescente (GFP) como marcador. La valoración de los resultados de transfección (sobreexpresión de GFP con pDNA o inhibición de GFP con siRNA) junto a la toxicidad producida en las líneas celulares, postulan a los DHPs de la serie de bis-MPA como mejores candidatos, ya que los homólogos de la serie bis-GMPA presentan una actividad prácticamente despreciable, probablemente debido a su menor internalización celular y a una menor disociación del material genético del dendriplejo. En concreto, la actividad como vector de transfección mejora conforme aumenta la generación del núcleo hiperramificado y son necesarios ratios N/P elevados para alcanzar buenos niveles de transfección e incluso superar a agentes comerciales muy eficaces.<br /

Direct Optofluidic Measurement of the Lipid Permeability of Fluoroquinolones.

Quantifying drug permeability across lipid membranes is crucial for drug development. In addition, reduced membrane permeability is a leading cause of antibiotic resistance in bacteria, and hence there is a need for new technologies that can quantify antibiotic transport across biological membranes. We recently developed an optofluidic assay that directly determines the permeability coefficient of autofluorescent drug molecules across lipid membranes. Using ultraviolet fluorescence microscopy, we directly track drug accumulation in giant lipid vesicles as they traverse a microfluidic device while exposed to the drug. Importantly, our measurement does not require the knowledge of the octanol partition coefficient of the drug - we directly determine the permeability coefficient for the specific drug-lipid system. In this work, we report measurements on a range of fluoroquinolone antibiotics and find that their pH dependent lipid permeability can span over two orders of magnitude. We describe various technical improvements for our assay, and provide a new graphical user interface for data analysis to make the technology easier to use for the wider community.The work was supported by an ERC Consolidator grant “DesignerPores” awarded to UFK. JC acknowledges support from the BBSRC. MS was supported by the Friedrich Naumann Foundation for Freedom and the Swiss- European Mobility Programme. KAN was supported by the Erasmus Plus student exchange programme. SHA is supported by a Herchel Smith Postdoctoral Fellowship. SP acknowledges support from the Leverhulme Trust through an Early Career Fellowship (ECF-2013-444).This is the final version of the article. It first appeared from Nature Publishing Group at http://dx.doi.org/10.1038/srep32824

Ionic conductivity, structural deformation, and programmable anisotropy of DNA origami in electric field.

The DNA origami technique can enable functionalization of inorganic structures for single-molecule electric current recordings. Experiments have shown that several layers of DNA molecules, a DNA origami plate, placed on top of a solid-state nanopore is permeable to ions. Here, we report a comprehensive characterization of the ionic conductivity of DNA origami plates by means of all-atom molecular dynamics (MD) simulations and nanocapillary electric current recordings. Using the MD method, we characterize the ionic conductivity of several origami constructs, revealing the local distribution of ions, the distribution of the electrostatic potential and contribution of different molecular species to the current. The simulations determine the dependence of the ionic conductivity on the applied voltage, the number of DNA layers, the nucleotide content and the lattice type of the plates. We demonstrate that increasing the concentration of Mg(2+) ions makes the origami plates more compact, reducing their conductivity. The conductance of a DNA origami plate on top of a solid-state nanopore is determined by the two competing effects: bending of the DNA origami plate that reduces the current and separation of the DNA origami layers that increases the current. The latter is produced by the electro-osmotic flow and is reversible at the time scale of a hundred nanoseconds. The conductance of a DNA origami object is found to depend on its orientation, reaching maximum when the electric field aligns with the direction of the DNA helices. Our work demonstrates feasibility of programming the electrical properties of a self-assembled nanoscale object using DNA.C.Y.L., J.Y. and A.A. were supported in part by the grants from the National Science Foundation (DMR-0955959, PHY-1430124 and ECC-1227034), and the National Institutes of Health (R01- HG007406). E.A.H. acknowledges support from Schweizerische Studienstiftung (Swiss Study Foundation) and Gonville & Caius College. S.H.A. acknowledges support from a Herchel Smith postdoctoral fellowship. J.K. acknowledges support from Chinese Scholarship Council and Cambridge Overseas Trust. UFK was supported by an ERC starting grant (PassMembrane, 261101). The authors gladly acknowledge supercomputer time provided through XSEDE Allocation Grant MCA05S028 and the Blue Waters Sustained Petascale Computer System (UIUC).This is the accepted manuscript. The final version is available from ACS at pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/nn505825z

Controlling the Reversible Assembly of Liposomes through a Multistimuli Responsive Anchored DNA.

We present a novel approach to reversibly control the assembly of liposomes through an anchored multistimuli responsive DNA oligonucleotide decorated with an azobenzene moiety (AZO-ON1). We show that liposomes assembly can be simultaneously controlled by three external stimuli: light, Mg(2+), and temperature. (i) Light alters the interaction of AZO-ON1 with liposomes, which influences DNA coating and consequently liposomes assembly. (ii) Mg(2+) induces the assembly, hence variation in its concentration enables for reversibility. (iii) Double-stranded AZO-ON1 is more efficient than single-stranded AZO-ON1 in triggering the assembly of liposomes and temperature has been used for controllable assembly through DNA thermal denaturation. Our multiresponsive AZO-ON1 represents a unique example in which multiple stimuli can be simultaneously applied to regulate the reversible assembly of liposomes.S.H.A. acknowledges support from a Herchel Smith postdoctoral fellowship. M. R. acknowledges support from an Early Postdoc Mobility fellowship of Swiss National Science Foundation. A. A and R. E. acknowledge support from MINECO, Spain, CTQ2014-52588-R. U.F.K. acknowledges support from an ERC Starting Grant Passmembrane 261101.This is the author accepted manuscript. It is currently under an indefinite embargo pending publication by ACS

Terapias cardiacas avanzadas con microRNAs basadas en nanoestructuras de DNA

La desregulación de microRNAs (miRNAs) se asocia con múltiples procesos incluidos el envejecimiento cardiaco y las enfermedades cardiovasculares (ECV). Por ello, se posicionan como prometedoras dianas terapéuticas. Para superar limitaciones en su uso como tal, se propone la creación de nanoestructuras de DNA (DNS) biocompatibles para crear terapias efectivas y seguras

Toxic and nutritional factors trigger Leber hereditary optic neuropathy due to a mitochondrial tRNA mutation

Leber hereditary optic neuropathy is a mitochondrial disease mainly due to pathologic mutations in mitochondrial genes related to the respiratory complex I of the oxidative phosphorylation system. Genetic, physiological, and environmental factors modulate the penetrance of these mutations. We report two patients suffering from this disease and harboring a m.15950G > A mutation in the mitochondrial DNA-encoded gene for the threonine transfer RNA. We also provide evidences supporting the pathogenicity of this mutation

Wrap to sort

DNA NanotechnologyModelling the structure and behaviour of vesicles in cells requires liposomes with precise sizes, but producing liposomes with a narrow size distribution is challenging. An approach has now been developed to accurately size-sort liposomes in a scalable way by coating them with customized structures based on DNA nanotechnology.Peer reviewe

Nuevos materiales funcionales basados en dendrímeros cristales líquidos iónicos

Los dendrímeros son un tipo específico de polímeros que se caracterizan por su arquitectura ramificada tridimensional, forma globular y control absoluto de las posiciones de las unidades estructurales. Esta estructura particular así como sus propiedades físico-químicas (monodispersidad, solubilidad, baja viscosidad en disolución y en fundido, bajas temperaturas de transición vítrea y elevada densidad de grupos terminales) ha suscitado un enorme interés científico tanto a nivel de investigación básica como aplicada. En concreto, los dendrímeros de poli(propilenimina) (PPI) y de poli(amidoamina) (PAMAM) han sido unos de los más estudiados en el campo de los cristales líquidos. El anclaje de unidades promesógenas a los grupos terminales de estas macromoléculas ha permitido la obtención de materiales con propiedades cristal líquido. En la mayoría de los casos esta funcionalización se ha realizado de manera covalente, pero en los últimos años la interacción iónica entre los grupos amino del dendrímero y los grupos carboxilo de las unidades sustituyentes ha surgido como un método más sencillo, rápido y versátil a la hora de obtener dendrímeros cristal líquido. La segregación entre partes de diferente naturaleza presentes en el dendrímero iónico funcionalizado es el fenómeno responsable de la aparición de mesomorfismo en estos materiales, aun cuando las unidades sustituyentes carecen de carácter mesógeno. Por otro lado el diseño previo de sustituyentes que posean una función determinada en su estructura permite la obtención de dendrímeros mesomorfos funcionales con potenciales aplicaciones tanto en el campo de la Ciencia de Materiales como en Biomedicina. Objetivo de la tesis doctoral: El objetivo principal de esta tesis doctoral ha sido la preparación de dendrímeros iónicos con propiedades de cristal líquido, buscando además que posean una función determinada. Más específicamente se van a abordar los siguientes objetivos: Objetivo 1: Estudio de la organización supramolecular de dendrímeros iónicos que posean en su estructura unidades de diferente naturaleza: fluorada y perhidrogenada. Objetivo 2: Estudio de la formación de estructuras ordenadas en agua a partir de dendrímeros iónicos anfífilos, buscando sistemas con aplicaciones en biomedicina. Objetivo 3: Estudio de la relación entre la estructura química y las propiedades ópticas y mesomorfas en dendrímeros iónicos con unidades de azobenceno. Objetivo 4: Estudio de las propiedades mesomorfas en dendrímeros iónicos con unidades de oxadiazol. En concreto se pretende obtener dendrímeros que presenten la mesofase nemática biaxial. Además, se va a evaluar las propiedades luminiscentes de estos compuestos.Peer Reviewe