Isolation and purification of Cu-free methanobactin from Methylosinus trichosporium OB3b

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>The isolation of highly pure copper-free methanobactin is a prerequisite for the investigation of the biogeochemical functions of this chalkophore molecule produced by methane oxidizing bacteria. Here, we report a purification method for methanobactin from <it>Methylosinus trichosporium </it>OB3b cultures based on reversed-phase HPLC fractionation used in combination with a previously reported resin extraction. HPLC eluent fractions of the resin extracted product were collected and characterized with UV-vis, FT-IR, and C-1s NEXAFS spectroscopy, as well as with elemental analysis and ESI-MS.</p> <p>Results</p> <p>The results showed that numerous compounds other than methanobactin were present in the isolate obtained with resin extraction. Molar C/N ratios, mass spectrometry measurements, and UV-vis spectra indicated that methanobactin was only present in one of the HPLC fractions. On a mass basis, methanobactin carbon contributed only 32% to the total organic carbon isolated with resin extraction. Our spectroscopic results implied that besides methanobactin, the organic compounds in the resin extract comprised breakdown products of methanobactin as well as polysaccharide-like substances.</p> <p>Conclusion</p> <p>Our results demonstrate that a purification step is indispensable in addition to resin extraction in order to obtain pure methanobactin. The proposed HPLC purification procedure is suitable for semi-preparative work and provides copper-free methanobactin.</p

Mutagenesis and expression of methane monooxygenase to alter regioselectivity with aromatic substrates

Soluble methane monooxygenase (sMMO) from methane-oxidising bacteria can oxygenate more than 100 hydrocarbons and is one of the most catalytically versatile biological oxidation catalysts. Expression of recombinant sMMO has to date not been achieved in Escherichia coli and so an alternative expression system must be used to manipulate it genetically. Here we report substantial improvements to the previously described system for mutagenesis of sMMO and expression of recombinant enzymes in a methanotroph (Methylosinus trichosporium OB3b) expression system. This system has been utilised to make a number of new mutants and to engineer sMMO to increase its catalytic precision with a specific substrate whilst increasing activity by up to 6-fold. These results are the first 'proof-of-principle' experiments illustrating the feasibility of developing sMMO-derived catalysts for diverse applications. [Abstract copyright: © FEMS 2017.

A four-helix bundle stores copper for methane oxidation

Methane-oxidising bacteria (methanotrophs) require large quantities of copper for the membrane-bound (particulate) methane monooxygenase (pMMO). Certain methanotrophs are also able to switch to using the iron-containing soluble MMO (sMMO) to catalyse methane oxidation, with this switchover regulated by copper. MMOs are Nature’s primary biological mechanism for suppressing atmospheric levels of methane, a potent greenhouse gas. Furthermore, methanotrophs and MMOs have enormous potential in bioremediation and for biotransformations producing bulk and fine chemicals, and in bioenergy, particularly considering increased methane availability from renewable sources and hydraulic fracturing of shale rock. We have discovered and characterised a novel copper storage protein (Csp1) from the methanotroph Methylosinus trichosporium OB3b that is exported from the cytosol, and stores copper for pMMO. Csp1 is a tetramer of 4-helix bundles with each monomer binding up to 13 Cu(I) ions in a previously unseen manner via mainly Cys residues that point into the core of the bundle. Csp1 is the first example of a protein that stores a metal within an established protein-folding motif. This work provides a detailed insight into how methanotrophs accumulate copper for the oxidation of methane. Understanding this process is essential if the wide-ranging biotechnological applications of methanotrophs are to be realised. Cytosolic homologues of Csp1 are present in diverse bacteria thus challenging the dogma that such organisms do not use copper in this location

Excavación y reconstrucción del montículo artificial del sitio El Tabor - Alto de Chinas, Municipio de San Agustín - Huila

El presente informe es el resultado de los trabajos realizados por el Instituto Colombiano de Antropología - ICAN en el contexto del proyecto EXCAVACION y RECONSTRUCIÓN DEL MONTICULO ARTIFICIAL DEL SITIO EL TASOR. MUNICIPIO DE SAN AGUSTlN - HUILA, presentado y aprobado en el mes de abril de 1994, siendo Director del Instituto el Dr. Roberto Pineda Camacho, y jefes de División de Arqueología y Desarrollo Antropológico: Mónica Therrien y Alvaro Botiva, respectivamente.La elaboración final de este informe se debe al permanente apoyo suministrado por el Doctor Luis Duque Gómcz, Director de la FlAN. El escrito final fue gentilmente leído por los colegas Jorge A. Alarcón G. y Liliana Segura L., quienes realizaron la corrección de estilo y elaboraron los gráficos finales. Igualmente agradezco los comentarios y sugerencias realizadas por el profesor Héctor Llanos.El motivo por el cual se decidió realizar esta investigación, se justifica por la necesidad de intervenir sitios que a pesar de no encontrarse en terrenos del Parque Arqueológico de San Agustín, presentaban riesgos inminentes de deterioro y saqueo, manifiestos en la intervención y disturbio producto de actividades de guaqueria comunes en la zona. La realización permanente de investigación, aparte de los proyectos regionales, significa un importante cambio en el manejo de los Parques Arqueológicos; consolidando un permanente monitoreo y observación de los sitios que requieren protección, preservación, vigilancia e investigación.Una vez tomada la decisión de realizar trabajos de protección y conservación en sitios con características y rasgos preferiblemente monumentales, se señaló áreas como EL TASOR (municipio de San Agustín) y BETANlA (municipio de Isnos), para desarrollar proyectos enmarcados dentro de la denominada Arqueología de Rescate, por tratarse de sitios puntuales con monumentalidad y circunscritos en una problemática especifica dentro de la misión institucional de vigilar, conservar y proteger el patrimonio Arqueológico Nacional.El sitio El TABOR es reconocido dentro de la literatura arqueológica como Florida Blanca, (Wavrin, 1936; Lunardi, 1924; P érez de Barradas, 1943). Mencionado por Duque en la zona del filo de Lavaderos (1964), dentro delos informes suministrados por Eduardo Unda; es descrito en el manual de Estatuaria del Macizo Colombiano por Sotomayor y Uribe (1987). En el informe realizado en el área periférica a El TASOR, se describe y menciona el contexto arqueológico del área monumental en la vereda de Llanadas del río Naranjos (Ordóñez; 1993).Actualmente el sitio se denomina Alto de Chinas, por haberse constituido como una vereda nueva mediante acuerdo municipal suscrito por el consejo de San Agustín. En lo que respecta a evidencias monumentales, contiene una estructura monticular con presencia de 2 sarcófagos, columnas basálticas y tumbas de cancel, que han sido guaqueadas permanentemente.Los trabajos de campo se realizaron en dos temporadas; la primera de ellas durante el mes de julio y la segunda durante los meses de agosto y septiembre de 1994. Los objetivos de la misma se centraron en la reconstrucción del montículo y la relación de material cerámico, obtenido en el proceso de excavación de unidades arqueológicas y pozos de sondeo periféricos.Los análisis de laboratorio están justificados con los objetivos propuestos; sin embargo, es importante resaltar que no se incluye la descripción de material lítico debido a la muy baja frecuencia de este elemento en el contexto de las excavaciones.La obtención de la fecha de carbón se realizó gracias a la colaboración del Dr. Luis Duque Gómez, Director de la Fundación de Investigaciones Arqueológicas del Banco de la República, FlAN. Desafortunadamente no pudimos obtener una fecha de TL asociada a un cuenco que apareció con la escultura antropomorfa excavada en la tumba No. 4 ; no obstante la colaboración del Museo del Oro del Banco de la República en cabeza de su Directora de entonces Clemencia Plazas y en especial del Subdirector Técnico del mismo Roberto Lleras.Colaboraron en la excavación las entonces estudiantes de la Universidad del Cauca, Marta Cecilia Hernández y Ma. Eugenia Orjuela, quienes fueron recomendadas por el Dr. Cristóbal Gnecco. De igual manera, miembros de la comunidad de la vereda El Tabor y la de Chinas, participaron como auxiliares de campo; sus nombres son: Carlos Ordóñez, José E. Armero y Ever Ortega; de igual manera, miembros de la Asociación de Guías de San Agustín GUIATUR.Agradecimientos a la administración municipal de ese entonces Sr. Ange l Valencia Rojas (Q.e.p.d..) y Luis Ildefonso Erazo, como al señor Propietario del predio Don Evier Becerra. Al equipo de trabajo del parque arqueológico, en especial al Administrador Alvaro Muñoz y a Baudelino Grijalva, Inspector de Monumentos y Orlando Zúñiga